软骨发育不全患者FGFR3突变基因分析

王尧 崔亚洲 周小燕 韩金祥

1.山东中医药大学 2011级 博士研究生 山东 济南 250355

2.山东省医药生物技术研究中心 国家卫生部医药生物技术重点实验室 山东省罕见病重点实验室,山东 济南 250062

软骨发育不全（achondroplasia,ACH,MIM:100800），又称为胎儿型软骨营养障碍（chondrodystrophia fetalis），或称软骨营养障碍性侏儒（chondrodystrophic dwarfism），是一种常染色体显性遗传病，外显率为100%。这种疾病是由于软骨内成骨缺陷而膜性化骨正常造成的，国内外都非常罕见，据国外研究机构统计，全球发病率大概为1/77000～1/15000[1]。在这些患者中80%～90%的新生儿为散发病例，由基因突变产生，10%～20%则是家系遗传导致。软骨发育不全患者的临床表现具有共同的特征[2-4]：四肢短小，头大、前额突出、塌鼻梁，肘关节不能伸直，双腿呈“O”型，伴有鸭步，随着年龄增长变得越来越明显；躯干部位发育正常，肋骨短，胸骨短而宽，空廓扁平，一般智力及其体力发育正常，并且性功能良好；手指方面短而粗大，呈现“三叉戟”状态，大拇指一组，食指跟中指为一组，无名指与小拇指为一组；脊柱主要表现为胸腰段后凸和椎管狭窄畸形。

成纤维生长因子受体3（fibroblast growth factor receptor 3,FGFR3）是一种发育调节的单次跨膜受体，参与和调控软骨和长骨发育的多个阶段，如软骨细胞的增生及软骨基质的钙化，是目前世界公认引起软骨发育不全的最主要的致病基因，其热点区域位于第10外显子。97%以上突变位点又集中在1138位核苷酸，其中95%为G＞A的碱基转换，其余为G＞C的颠换。两种突变都导致FGFR3第380位甘氨酸由精氨酸取代(G380R)，从而引起FGFR3蛋白功能表达异常，影响了软骨细胞的增生和钙化，使软骨发育生长受到阻碍停滞从而导致软骨发育不全疾病的产生[5-9]。本研究主要通过毛细管测序方法对软骨发育不全患者进行基因筛查，以确定患者是否为软骨发育不全。

1 材料与方法

1.1 研究对象 本实验中以9例初步诊断为软骨发育不全的患者及其他们的父母为研究对象，共27人。其中9例患者的年龄大多在2～5岁，身高大约在60～80cm，临床症状较为典型，例如四肢短小，头大、前额突出、塌鼻梁，肘关节不能伸直，双腿呈“O”型，并且具有典型的“三叉手”。患者的父母均为正常人，没有发病症状。上述参与实验的人员均获得并签署了知情同意书，提供自己的DNA为研究样本。

1.2 研究方法

1.2.1 血液DNA提取：我们抽取上述患者及其父母的外周静脉血液2～3ml（EDTA抗凝混匀），采用OMEGA公司Blood DNA Midi Kit从血液中提取DNA，用紫外分光光度计对DNA进行检测，A260/A280约为1.82。

1.2.2 引物序列设计：本实验依据NCBI提供的FGFR3基因序列，使用primer premier 5.0设计外显子10的PCR扩增所需要的引物，引物序列及退火温度如表1所示

1.2.3 PCR扩增：本实验使用的PCR扩增试剂盒是TAKALA公司的PCR Amplification Kit。每个反应的总体积为25μl，其中反应体系内包括DNA模板50～200 ng，上游引物与下游引物各1μmol/L，dNTP各200μmol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，10×PCR缓冲液2.5μl，Taq DNA聚合酶1U，其余用水补齐。热循环仪使用的是PTC-200常规PCR仪，反应条件如下：95℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循环35个周期，最后72℃延伸10min。PCR反应结束后，将扩增产物放入1%的琼脂糖凝胶上进行电泳跑胶，观察PCR扩增结果。扩增片段大小为341bp。电泳结果如图1所示。

图1 9例软骨发育不全患者PCR扩增电泳图

图2 上述序列为反向引物测序峰图。箭头所示位点为患者FGFR3外显子10的c.1138位点G＞A。

图3 上述序列为反向引物测序峰图。箭头所示位点为患者FGFR3外显子10的c.1138位点G＞A。

图4 上述序列为反向引物测序峰图。箭头所示位点为正常家属FGFR3外显子10的c.1138位点。

1.2.4 PCR扩增产物纯化及其测序：将扩增好的PCR产物用纯化试剂盒进行纯化，去除产物中的非特异性扩增产物及其引物二聚体等杂质，本实验使用的试剂盒是QIAGEN公司QIAquick PCR Purification Kit。将纯化好的产物送去华大基因测序部，使用ABI公司的3730XL测序仪对纯化产物进行测序。

3 结 果

对FGFR3外显子10测序分析 通过对9例患者及其父母进行FGFR3外显子10测序，我们重点分析了1138位点核苷酸及1123位点核苷酸突变情况。其中9例初步诊断为软骨发育不全患者的测序图谱中，在1138位点处均出现了杂合峰图（c.1138 G＞A），而1123位点没有杂合峰图，表明这些病人确实是软骨发育不全患者。而在患者的父母测序峰图中，1138位点核苷酸及1123位点核苷酸均没有发现杂合峰图，表明患者父母均为正常。这结果提示在中国的人群中FGFR3外显子10的1138位点核苷酸突变也是导致软骨发育不全疾病产生的原因[10]。在这9对家庭中，患者都属于散发病例，没有出现家族遗传性，这与先前文献报道的70%～80%软骨发育不全患者属于散发病例基本一致[11-12]。此外，这些病例中都为c.1138 G＞A，没有出现c.1138 G＞C，这也与国外报道基本一致[11-12]。图2和图3是其中两个患者的基因测序峰图，图4为其中一个患者家属的测序峰图。

4 讨 论

软骨发育不全是一种罕见的常染色体显性遗传疾病，外显率为100%，发病率为1/77000～1/15000[1]，由基因突变产生。成纤维生长因子受体3（FGFR3）是引起软骨发育不全的最重要的致病基因，其本质是酪氨酸激酶受体，由细胞外糖基化配体结合区、疏水跨膜区和细胞内酪氨酸激酶催化区3部分组成[13]。Shiang等[14]1994年通过聚合酶链反应（PCR）结合单链构象多态性（SSCP）和限制性内切酶酶解的方法对软骨发育不全患者进行基因筛查发现患者FGFR3基因都有突变，而且突变位置都位于FGFR3疏水跨膜区，提示疏水跨膜区可能是影响软骨发育的热点区域。Perez-Custro等[15]进一步对FGFR3基因进行研究，发现该基因长约15Kb，共有19个外显子以及18个内含子，其中引起软骨发育不全的突变位点在第10号外显子上，恰巧此外显子编码FGFR3基因的疏水跨膜区，进一步明确该基因突变位点与疏水跨膜区有密切联系。

FGFR3基因主要由两处碱基位点突变来引起软骨发育不全，分别是：c.1138 G＞A和c.1138 G＞C，属于单碱基突变。这两种碱基突变的结果导致编码的第380位氨基酸由甘氨酸（Gly）转变成精氨酸（Arg），使蛋白质功能发生改变，从而引起软骨发育不全。其中97%软骨发育不全患者都是由这两种碱基突变造成，又以c.1138 G＞A为主要突变方式，所占比例达到95%以上。本研究中，我们在9例散发的软骨发育不全患者上检测到FGFR3基因第10外显子G380R突变，结果支持G380R是ACH最常见的突变这一结论，并且证明这种高度一致性的突变在中国ACH患者中也存在[10]。9名患者的G380R突变都是由于FGFR3基因1138位核苷酸G＞A转换所致，未检测到G＞C颠换，与西方国家、日本报道的研究结果相似[16-17]。除此之外，1995年瑞典和日本的科学家发现了第三处碱基突变位点，他们在一例散发和一例家系中分别发现了c.1123 G＞T，导致编码的第375位氨基酸由甘氨酸（Gly）转变成半胱氨酸（Cys），但此类突变发生的概率很低，占所有突变比例的1%～2%[18-19]，在本实验中所有患者及其父母在这个位点均没有发现此类型突变。

本实验采用毛细管测序方法检测患者FGFR3基因突变，这种方法是目前最直接，最有效的检测基因突变方法之一。由于引起此疾病的热点突变都集中在FGFR3的外显子10中，因而可以通过这种方法对患者及其疑似患者做基因水平诊断，从而可以准确的判定患者是否如软骨发育不全，加以针对性救治。除此之外，毛细管测序还可以应用于产前诊断及胎儿检查，以判定胎儿是否为软骨发育不全患者。在未来，通过对基因测序的方式来诊断软骨发育不全必定有着较为广泛的应用前景。

1.Baujat G,Legeai-Mallet L,Finidori G,et al.Achondroplasia.Best Pract Res Clin Rheumatol,2008,22(1):3-18.

2.Carter EM,Davis JG,Raggio CL.Advances in understanding etiology of achondroplasia and review of management.Curr Opin Pediatr,2007,19(1): 32-37.

3.钟玉敏,朱铭,陈树宝等.永存第五对主动脉弓[J].罕少疾病杂志,2000,7(1): 1-2.

4.王成林,林贵.罕见病少见病的诊断与治疗[M].北京: 人民卫生出版社,1999,215-216.

5.Richette P,Bardin T,Stheneur C.Achondroplasia: from genotype to phe-notype.JointBone Spine,2008,75(2):125-130.

6.Hung CC,Lee CN,Chang CH,et al.Genotyping of the G138A mutationof the FGFR3 gene in patientswith achondroplasia using high-resolutionmelting analysis.Clin Biol,2008,41(3):162-166.

7.Patil SJ,Banerjee M,Phadke SR,et al.Mutation analysis in indian chil-dren with achondroplasiautility ofmolecular diagnosis.Indian J Pediatr,2009,76(2):147-149.

8.Reddy PL,Grewal RP.The G1138A mutation rate in the fibroblast growthfactor receptor3 (FGFR3)gene is increased in cells carrying the t(4;14)translocation.Genet Mol Res,2009,8(2): 435-439.

9.Zhang SR,Zhou XQ,Ren X,et al.Ser217Cys mutation in the Ig II do-main of FGFR3 in a Chinese familywith autosomal dominant achondroplasia.Chin Med J,2007,120(11): 1017-1019.

10.麻宏伟,姜俊,吕峻峰等.FGFR3基因突变分析在产前诊断及短肢畸形胎儿中的应用.中国实用儿科杂志,2005,20:242-243.

11.Bellus GA,Hefferon TW,Ortiz de Luna RI,et al.Achondroplasia is defined by recurrent G380R mutations of FGFR3.Am J Hum Genet,1995,56(2):368-373.

12.Ornitz DM,Marie PJ.FGF signaling pathways in endochondral and intramembranous bone developmentand human genetic disease.Genes Dev,2002,16(12): 1446-1465.

13.Benoist-Lasselin C,Gibbs L,Heuertz S,et al.Human immortalized chondrocytes carrying heterozygous FGFR3mutations: An in vitromodel to study chondrodysplasias.FEBS Letters.2007; 581:2593-2598.

14.Shiang R,Thompson LM,Zhu YZ,et al.Mutations in the transmembrane of FGFR3 causes the most common genetic form of dwarfism,achondroplasia.Cell,1994,78(2):335.

15.Perez-Castro AV,Wilson J,Altherr MR.Genomic organi-zation of the human fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3)gene and comparative sequence analysis with the mottse FGFR3 gene.Genomics,1997,41:10.

16.Lazarus JE,Hegde A,Andrade AC,et al.Fibroblast growth factor expression in the postnatal growth plate.Bone.2007; 40: 577-586.

17.Baca KE,Abdullah MA,Ting BL,et al.Surgical decompression for lumbar stenosis in pediatric achondroplasia.J Pediatr Orthop.2010; 30:449-454.

18.Ikegawa S,Fukushima Y,Isomura M,et al.Mutation of the fibroblast growth factor receptor 3 gene in one familial and six sporadic cases of achondroplas in Japanese patients.Hum Genet,1995,96:309-311.

19.Superti-Furga A,Eich G,Bucher HU,et a1.A glycine 375 to cysteine substitution in the transmembrane domain of the fibroblast growth factor receptor 3 in a newborn with achondroplasia.Eur J Pediatr,1995,154:215-219.