糯米藕类黑精提取工艺及其体外的抗氧化活性*

王明慧，闫佳，韩永斌，顾振新

1(南京农业大学农业部农畜产品加工与质量控制重点开放实验室，江苏南京，210095)

2(南京市鼓楼区卫生监督所，江苏南京，210009)

糯米藕是以新鲜莲藕为原料，揣入混有糖液的糯米，经高温煮制等工序制成的，是我国传统的莲藕制品之一，香甜可口、食用方便且营养卫生，深受消费者喜爱［1］。类黑精是糯米藕在加工过程中还原糖与氨基化合物发生美拉德反应产生的伴有芳香气味的红褐色物质［2－3］，是不同种类高分子量化合物组成的水溶性复杂混合物［4］。研究发现美拉德反应产物具有良好的抗氧化活性［5－8］，是一种天然的抗氧化剂，并赋予食品芳香风味，此外，还具有抗突变、诱变等功能［9－10］，其在人体内经酶活化，可能具有较强吸附病毒、细菌和人体内代谢产物作用，可调整机体内环境紊乱［11－12］;类黑精具有类似膳食纤维的功能，可降低人体餐后血糖等［13］。目前较多的研究集中在果蔬制品美拉德反应产物提取［14－17］和体外美拉德反应产物定性定量制备研究其结构及抗氧化活性方面［18－21］。对糯米藕制品的研究主要集中在其加工过程中褐变控制方面［1，22－23］，尚未见对糯米藕中美拉德反应产物类黑精的抗氧化活性研究。本研究在对糯米藕类黑精提取方法优化的基础上，研究了其类黑精抗氧化活性。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

糯米藕:11月份生产，真空包装，江苏省扬州花扇蔬菜食品有限公司提供;无水乙醇(分析纯)，南京化学试剂有限公司;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 (1，1-Diphenyl-2-picrylhydraztl)(分析纯)，上海伊卡生物技术有限公司;K3Fe(CN)6(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司;三氯乙酸(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司;FeCl3(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司;FeSO4(分析纯)，西陇化工股份有限公司;水杨酸(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司;H2O2纯试剂，南京化学试剂有限公司;去离子水等。

JA2003型电子天平，上海精密科学仪器有限公司;HH-6型数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司;TDL-40B离心机，上海安亭科学仪器厂;UV-2802型紫外可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 糯米藕类黑精提取工艺

1.2.1.1 提取溶剂浓度的选择

准确称取2.5 g糯米藕(去除糯米部分，下同)样品9份，按料液比1∶30分别加入0%(蒸馏水)、10%、20%、30%、45%、60%、70%、85%、100% 乙醇水溶液各50 mL，于室温 (20℃)研磨均匀后浸提2 h，12 000 r/min离心15 min，取上清液于420 nm处比色，以吸光值A反应糯米藕中提取的类黑精含量，其中，A值与类黑精量呈正相关性［7］。

1.2.1.2 料液比的选择

准确称取2.5 g糯米藕样品6 份，按 1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 料液比分别加入体积分数 10%乙醇水溶液，室温研磨均匀后浸提2 h，12 000 r/min离心15 min，取上清液于420 nm处比色，测定吸光值A。

类黑精量(AV值)=A(吸光度值)×V(相对体积比倍数)［15］。

1.2.1.3 提取时间的选择

准确称取2.5 g糯米藕样品8份，按1∶30料液比分别加入体积分数10%乙醇水溶液，室温研磨均匀后分别浸提 0、0.5、1、2、4、6、9、12 h，12 000 r/min离心15 min，取上清液于420 nm处比色，测定吸光值A。

1.2.1.4 提取温度的选择

准确称取2.5 g糯米藕样品7份，按1∶30料液比分别加入体积分数10%乙醇水溶液，室温研磨均匀后，分别于 20、40、60、70、80、90、100 ℃下浸提 2 h，取出后立即用冷水冷却至室温，12 000 r/min离心15 min，取上清液于420 nm处比色，测定吸光值A。

1.2.1.5 提取工艺参数正交实验设计

在单因素的基础上，以420 nm处吸光度A值和AV值为指标，选取对糯米藕类黑精的提取率影响较显著的乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度4个因素进行L9(34)正交实验，直观分析确定糯米藕类黑精提取的最佳工艺条件。正交实验因素水平见表1。

表1 L9(34)正交试验因素水平Table 1 The factors and levels of L9(34)orthogonal design

1.2.2 糯米藕类黑精的抗氧化活性

1.2.2.1 样品预处理

准确称取2.5 g糯米藕样品，按1∶40料液比加入体积分数10%乙醇研磨均匀，80℃水浴浸提1.5 h，取出后立即用冷水冷却，12 000 r/min下离心15 min，取上清液待用。以类黑精提取原液的浓度为1.0，分别稀释成 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 倍，测定不同浓度类黑精的抗氧化活性指标。

1.2.2.2 糯米藕类黑精清除DPPH·活性

取不同浓度样品溶液1.0 mL于试管中，分别加入0.3 mL 0.4 mmol/L DPPH无水乙醇溶液，再加入2.0 mL蒸馏水，混匀后常温避光反应30 min，于紫外分光光度计517 nm处测定其吸光值，为A1;以蒸馏水代替样品溶液测定的吸光值为A0;无水乙醇代替DPPH·溶液测定的吸光值为A2;以蒸馏水代替样品溶液、无水乙醇代替DPPH溶液，作空白实验调零，清除率由以下公式得出［25］:

清除率/%=［A0－(A1－A2)］/A0×100

1.2.2.3 糯米藕类黑精的还原力

取不同浓度样品溶液1.0 mL于离心管中，分别加入2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6磷酸缓冲液、2.5 mL 10 g/L K3Fe(CN)6溶液，混匀后置于50℃水浴中反应20 min，取出后立即用冷水冷却，并加入2.5 mL 100 g/L三氯乙酸溶液，混匀后于3 000 r/min离心10 min。取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸馏水和1 mL 1 g/L FeCl3溶液，混匀静置10 min，700 nm处测定其吸光值(A样品)，以蒸馏水代替样品溶液作空白对照(A对照)，还原力由以下公式得出［25］:

还原力/%=(A样品－A对照)×100

1.2.2.4 类黑精的羟基自由基清除能力［24，26］

取5 支试管，依次为 1、2、3、4、5，分别加入 1 mL 9 mmol/L FeSO4溶液和2 mL 9 mmol/L水杨酸乙醇溶液，按不同编号依次加入2 mL不同浓度样品溶液，和2 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液，室温下反应1 h后于510 nm处测定其吸光值AS，以蒸馏水代替样品溶液作空白A0，以蒸馏水调零，清除率由以下公式得出:

清除率/%=(A0－AS)/A0×100

1.2.2.5 数据统计与分析

实验设3次重复，结果采用 Excel和 Sigmaplot10.0软件对实验数据进行整理和图形处理，SPSS20.0软件进行显著性分析 (P＜0.05)。

2 结果与分析

2.1 糯米藕类黑精提取工艺单因素及正交实验结果

2.1.1 乙醇体积分数对糯米藕类黑精提取率的影响

由图1可知，随着乙醇体积分数的增大，糯米藕类黑精的提取量(AV420值)呈现先增加后逐渐降低的趋势。乙醇体积分数为10%时提取量达到最大，OD420值为0.17;随着乙醇体积分数进一步增加，类黑精的提取量显著下降(P＜0.05)，并在乙醇体积分数为100%时达到最小，OD420值为0.03。体积分数10%的乙醇提取的类黑精量显著高于其他乙醇体积分数(P＜0.05)，但与对照(蒸馏水)无显著差异(P＞0.05)。有研究指出，乙醇溶液有助于沉淀一些水溶性蛋白［15］，且醇溶液中的类黑精比水溶液中更稳定［7］。因此，本试验选取浸提剂为体积分数10%的乙醇水溶液。

图1 乙醇体积分数对糯米藕类黑精提取率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction of Melanoidin in Lotus root filled with sticky rice

2.1.2 料液比对糯米藕类黑精提取率的影响

随着料液比增加，糯米藕类黑精提取量呈先迅速增加后趋于稳定再下降的趋势。料液比为1∶30时，类黑精提取AV值为3.22，提取量达到最大，其中1∶30与1∶10、1∶20 间无显著差异(P ＞0.05)(图2)。这可能由于一定范围内增加提取溶剂量有助于提高溶剂扩散率和传质速率，但溶剂量过大会导致提取完全所需时间相应延长，且浸出的类黑精对未浸出产物有一定抑制作用［27，28］。因此选择料液比为 1∶10～1∶30可达到良好的提取效果。

图2 料液比对糯米藕类黑精提取提取率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction of Melanoidin in Lotus root filled with sticky rice

2.1.3 提取时间对糯米藕类黑精提取率的影响

如图3所示，提取时间1 h内，类黑精提取量显著增加(P＜0.05)，在1 h时达到最大，OD420值为0.11;当提取时间在1～4 h时，提取量无显著性差异(P＞0.05);提取时间为4～6 h时类黑精提取量明显下降(P＜0.05)，12 h后达到最低，OD420值为0.08。可能原因是随着时间的延长，浸提出的杂质量增多，有效成分含量下降，也可能是溶剂挥发引起溶剂浓度下降，导致提取率降低［27］。

图3 提取时间对糯米藕类黑精提取率的影响Fig.3 Effect of time on the extraction of Melanoidin in Lotus root filled with sticky rice

2.1.4 提取温度对糯米藕类黑精提取率的影响

如图4所示，随着提取温度的升高，糯米藕类黑精提取量显著增加，至90℃达到最高，OD420值为0.44，当提取温度为100℃时，提取量却显著降低(P＜0.05)，OD420值为0.26。可能是由于温度升高，有助于促进产物中可溶性成分的溶解和扩散速度，但温度过高，容易破坏类黑精的结构，导致分解、变质或挥发散失［27，29－30］。

图4 提取温度对糯米藕类黑精提取率的影响Fig.4 Effect of temperature on the extraction of Melanoidin in Lotus root filled with sticky rice

2.1.5 正交试验结果

由单因素实验可知，乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取温度均会影响糯米藕中类黑精提取效果。因此，在单因素实验基础上，选取以上四因素进行L9(34)正交试验优化(表2)和结果的方差分析(表3)。

由表2、表3可知，各因素对糯米藕类黑精提取效果的影响主次顺序依次为:D＞A＞C＞B，即提取温度对糯米藕类黑精提取效果影响最大，其次为乙醇浓度、提取时间，料液比对糯米藕类黑精提取效果影响最小，其中，A、C、D对糯米藕类黑精提取效果影响显著，最佳水平组合为A2B3C3D3，即提取溶剂选取体积分数10%乙醇，按料液比1∶40(g∶mL)研磨均匀，提取温度为80℃，提取时间为1.5 h。按最佳条件进行验证性试验，测得糯米藕类黑精提取AV值为8.235，此结果高于正交试验中任意组合的产物提取量，说明正交实验结果可靠，提取工艺可行。

表2 正交试验结果Table 2 The results of orthogonal experiment

表3 方差分析结果Table 3 The results of analysis of variance

2.2 糯米藕类黑精的抗氧化活性

2.2.1 糯米藕类黑精的DPPH.清除能力

由图5可知，糯米藕类黑精提取液具有DPPH·清除能力，且随着产物浓度的增加其清除能力增强。当其相对浓度为0.2时，类黑精提取液的DPPH·清除能力为40.24%，到相对浓度为0.4时，显著增加(P＜0.05)到44.72%;在相对浓度0.4～0.8范围内，DPPH·清除能力无显著增加趋势(P＞0.05)，但当类黑精提取液相对浓度到1.0时，其DPPH·清除能力迅速增加，并达到最强，为53.39%，显著高于其他浓度(P＜0.05)。说明糯米藕中类黑精具有较强的抗氧化活性，并随浓度的增大而增强。

图5 不同浓度糯米藕类黑精的DPPH·清除能力Fig.5 DPPH radical scavenging activity of Melanoidin with different concentration in Lotus root filled with sticky rice

2.2.2 糯米藕类黑精的还原能力

还原力与抗氧化性密切相关，还原力大的原料是良好的电子供体，使Fe3+还原成Fe2+，并能与自由基结合成较稳定物质，中断自由基链式反应［31－32］。由图6可见，糯米藕类黑精提取液具有显著的还原力(P＜0.05)，并随着浓度的增加而增强。当其相对浓度为0.2时，类黑精提取液的还原力为4.05%，随着浓度增大，其还原力逐渐增大，并在浓度为1.0时达到最大值，为15.95%，分析得到糯米藕类黑精浓度与其还原能力具有良好的线性关系，表达式为:y=0.147 5 x+0.013，R2=0.998 7。表明糯米藕类黑精的还原能力与其浓度间具有良好的线性关系，并随浓度增加而增强。

图6 不同浓度下糯米藕类黑精的还原能力Fig.6 Reducing power of Melanoidin with different concentration in Lotus root filled with sticky rice

2.2.3 糯米藕类黑精的羟基自由基清除能力

羟基自由基(·OH)清除率能有效反应物质的抗氧化性，·OH的氧原子上含有一个未配对电子，夺取电子能力很强，在过渡金属离子催化作用下，过氧化氢可发生均裂产生羟自由基［32－33］。如图7所示，糯米藕类黑精提取液具有·OH清除能力，并随着提取液浓度的增加而增强。在产物提取液相对浓度为0.2和0.4时，其羟基自由基清除能力不强，分别为0.94%和1.39%，但仍具有一定的清除能力(P＞0.05)。随着类黑精浓度进一步增加，其羟基自由基清除能力增加显著(P＜0.05)，至相对浓度为1.0时，其羟基自由基清除能力达到10.16%。表明糯米藕中类黑精具有一定的抗氧化性，并随着浓度的增大而增强。

图7 不同浓度下糯米藕类黑精的羟自由基清除能力Fig.7 Hydroxyl radical scavenging capacity of Melanoidin with different concentration in Lotus root filled with sticky rice

3 结论

本研究发现，糯米藕中类黑精提取的最佳工艺条件为:提取溶剂体积分数10%乙醇，料液比1∶40(g∶mL)，浸提温度80℃，浸提时间1.5 h，按此最佳条件进行糯米藕类黑精提取，得类黑精提取AV值为8.235，此结果高于正交试验中任意组合的提取量，说明该提取工艺可行。

糯米藕类黑精具有1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)清除能力、还原力及羟基自由基(·OH)清除能力，并与浓度呈显著正相关，相对浓度为1.0(提取原液)时，还原力为15.95%，DPPH·清除能力为53.39%，·OH清除能力为10.16%。表明糯米藕中类黑精具有较强的抗氧化能力。

糯米藕中的类黑精是食品加工和贮藏过程中自身产生的，并赋予食品良好风味，其抗氧化能力较强，是一种天然的抗氧化剂。糯米藕类黑精结构及其他生物活性，以及糯米藕储藏期与其类黑精含量、结构的关系，有待进一步研究。

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