基质与微生物之比(F/M)对酱渣厌氧发酵产酸的影响*

齐希光，李秀芬

1(江南大学 食品学院，江苏无锡，214122)2(江南大学 环境与土木工程学院，江苏无锡，214122)

我国是酱油生产及消费大国，仅2010年，就产生了约470万t的酱渣(含水75%)。酱渣是指酿造酱油原料经制曲、发酵、淋出酱油后产生的固体残渣。酱渣(干基)中含有约20%～30%粗蛋白、7%～18%粗脂肪、10%以上碳水化合物、20%～24%粗纤维、8%～12%水分、0.5%～2%盐分和丰富的矿物质，再利用价值很高。目前，酱渣主要是用作肥料和饲料，但由于含盐度高，用量受到限制［1］。而其回收利用和深度加工尚处于研究阶段，主要集中在提取油脂、膳食纤维、黄酮和鲜味剂等成分，研究结果尚不理想。

有机废弃物厌氧发酵会产生多种挥发性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)，如乙酸、丁酸等，可作为发酵工业原料生产高附加值的发酵产品(如角质酶)，或作为化工原料合成其他产品(如聚乳酸)。研究表明［2］，厌氧生物处理过程中基质与微生物之比(F/M)对其进程影响很大。一般来说，较高的F/M可获得较多的产物，但转化率较低，高浓度底物也可能对产酸具有抑制作用。Ginkel等［3］研究发现，当发酵底物葡萄糖浓度为10～30 g/L时，产生的有机酸质量占总酸化产物的比例高达90%以上，而当葡萄糖浓度上升至40 g/L时，比例降低到38%。而较低的F/M同样会降低有机酸的产量。

目前，生物质厌氧发酵产酸的研究主要集中在污水处理厂污泥、餐厨垃圾、蓝藻等的处理，而有关酱渣厌氧发酵产酸研究报道鲜见。通过优化酱渣厌氧发酵产酸的F/M，将酱渣中的有机成分尽可能多地转化成乙酸等挥发性脂肪酸，可在实现酱渣减量化的同时，生产高附加值产品。

1 材料和方法

1.1 实验材料及操作条件

酱渣(江苏某酿造厂)溶液浓度为100 g/L，用4 mol/L的HCl和NaOH调节pH至11.0，90℃预处理2 h，离心后的上清液作为发酵产酸的底物。其中，可溶性蛋白质和碳水化合物的浓度分别为3.5～5.0 g/L和3.0～4.0 g/L。接种污泥为无锡市某污水处理厂的消化污泥，其VS/TS为62.90%。将此污泥放入有效容积为2 L的UASB反应器中驯化［4］，所得酸化接种污泥的VS/TS为78.10%。初始发酵pH值为9.0，F/M(即酱渣预处理液与接种污泥质量之比)分别为 1∶0，1∶1，3∶1，5∶1，10∶1，20∶1和 50∶1。充 3 min氮气后用橡胶塞密封，放入120 r/min的摇床中厌氧发酵 10 d［5－6］，发酵温度为 35 ℃。

1.2 分析测试项目及方法

1.2.1 VFA的浓度

测定前样品预处理:取5 mL厌氧产酸发酵液，8 000 r/min离心5 min，用0.45 μm的微滤膜过滤，取滤液0.5 mL于离心管中，加入同体积0.835 g/L的4-甲基戊酸溶液(作为内标)和同体积3 mol/L的磷酸溶液(促使溶液中的VFA在进样室内气化)，混匀，再次8 000 r/min离心5 min，取1 mL上清液装入气相色谱进样瓶，进岛津2010气相色谱仪检测。气相色谱测定参数:AOC-20i自动进样器;FID检测器;PEG-20M毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.5 μm，大连中汇达科学仪器有限公司);采用一阶程序升温，初温80℃，保持3 min，后以15℃/min的速率升至210℃，保持2 min。进样室和检测器的温度都设为250℃。

1.2.2 蛋白酶的活性

蛋白酶活性的测定根据GB/T23527－2009方法进行，即利用蛋白酶分解酪素(底物)生成含酚基氨基酸与福林-酚试剂的显色反应，来间接测定蛋白酶的活力。具体步骤为:A.将样品组(包括1 mL酶样即离心后上清液和1mL 10 mg/mL的酪素溶液)和空白组(1 mL酶样和2 mL 0.4 mol/L三氯乙酸)40℃加热10 min。B.在样品组加入2 mL 0.4 mol/L三氯乙酸，向空白组加入1mL 10 mg/mL的酪素溶液，静置10 min后过滤。C.各取滤液1 mL，分别加5 mL 0.4 mol/L的Na2CO3和1 mL福林-酚试剂，40℃显色20 min后，680 nm吸光度下比色。1 mL酶样在40℃(酸性pH=3.0、中性pH=7.5、碱性pH=10.5)条件下，1 min水解酪素产生1 μg酪氨酸为1个酶活力单位。酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶的活性需分别测定，酪素溶液也分别用乳酸缓冲液(pH=3.0)、磷酸缓冲液(pH=7.5)和硼酸缓冲液(pH=10.5)配制。

1.2.3 α-淀粉酶的活性

淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3，5-二硝基水杨酸试剂测定，麦芽糖能将3，5-二硝基水杨酸还原成3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质)，其颜色的深浅与糖的含量成正比，故可求出麦芽糖的含量。常用单位时间(1 min)内生成麦芽糖的质量(mg)表示淀粉酶活性的大小。具体步骤为:(1)样品组和空白组都包括有1 mL的酶液，首先在70℃恒温水浴中(水浴温度的变化不应超过±0.5℃)加热15 min，在此期间β-淀粉酶钝化。(2)取出后，迅速在水浴中彻底冷却。(3)样品组和空白组各加入1 mL pH 5.6柠檬酸缓冲液。(4)向空白组中加入4 mL 0.4 mol/L NaOH，以钝化酶的活性。(5)将样品组和空白组置于40℃(±0.5℃)恒温水浴中准确保温15 min。(6)分别加入40℃下预热的1% 的淀粉溶液2 mL，摇匀，立即放入40℃水浴中准确保温5 min。(7)取出后，向样品组迅速加入4 mL 0.4 mol/L NaOH，以终止酶的活性，然后准备下一步糖的测定。(8)取以上样品组中酶作用后的溶液及空白组中的溶液各1 mL，分别放入15 mL具塞刻度管中，再加入1 mL 3，5-二硝基水杨酸试剂混匀，置于沸水浴中煮沸5 min。(9)冷却，用蒸馏水稀释至15 mL，混匀，510 nm吸光度下比色。

1.2.4 其他指标及测定方法

蛋白质含量采用考马斯亮蓝G250染色法测定［7］;碳水化合物含量采用苯酚-硫酸法测定［8］。

2 结果与讨论

2.1 F/M对溶解性蛋白质和碳水化合物降解的影响

厌氧发酵10 d后，系统F/M对厌氧发酵前后可溶性蛋白质浓度的影响如图1所示。系统F/M越低，微生物的相对数量越多，降解转化蛋白质能力越强，所得降解速度越快，在F/M为1∶1时，可溶性蛋白质降解率最高，达71.23%。在F/M为1∶0时，即未添加酸化接种污泥时，蛋白质也有所降解，这可能是因为环境中本身存在一定微生物，因此也存在一些代谢活动，导致部分蛋白质被降解。不同F/M条件下，发酵前后可溶性碳水化合物浓度变化如图2所示。可见，F/M对碳水化合物的降解规律类似蛋白质，F/M越低，微生物数量越多，降解转化碳水化合物的能力越强，同样，在F/M为1∶1时，碳水化合物降解率最高，达73.43%。在F/M为1∶0时，即未添加酸化接种污泥时，碳水化合物也有所降解，原因同上。

图1 F/M比对可溶性蛋白质降解的影响Fig.1 Influence of F/M on the degradation of soluble proteins

2.2 F/M对蛋白酶活性的影响

图2 F/M可溶性碳水化合物降解的影响Fig.2 Influence of F/M on the degradation of soluble carbohydrates

水解通常被认为是厌氧发酵过程中的限速步骤。胞外水解酶能够加速蛋白质和碳水化合物等有机底物水解产酸，因此，胞外水解酶的活性在VFA产生过程中起着重要作用，水解酶的活性可间接反映厌氧酸化的程度。不同F/M条件下，酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶活性随发酵时间的变化如图3、图4和5所示。可见，随F/M比降低，蛋白酶活性逐步升高，并在F/M为1∶1时达最大，此时，酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶的活性分别为5.336、3.964和4.726 U/mL。较低的F/M意味着接种的酸化污泥量相对较高，产酸微生物的数量相对较大，其生长代谢分泌的水解蛋白酶相应增加，对可溶性蛋白质的分解能力相应增强。这与之前研究得出的结论“蛋白质降解率在F/M为1∶1时达到最大值”相呼应。废弃酱渣厌氧发酵产酸过程中酸性、中性和碱性蛋白酶活性的变化趋势，与张无敌等［9］研究鸡粪厌氧消化过程中水解蛋白酶活性的研究结果及Jones等［10］研究生活垃圾中蛋白质等有机质发酵过程蛋白酶活性的变化趋势均一致。

图3 F/M对发酵过程中酸性蛋白酶活性的影响Fig.3 Influence of F/M on the activity of acid-protease

同时可以发现，酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶活性均随发酵时间延长而呈现先增加后降低的趋势，酸性蛋白酶活性在发酵2 d时达到最大值，中性蛋白酶活性在4 d时达到最大值，而碱性蛋白酶活性的最大值出现在6 d左右。

2.3 F/M对α-淀粉酶活性的影响

图4 F/M对发酵过程中中性蛋白酶活性的影响Fig.4 Influence of F/M on the activity of neutral-protease

图5 F/M对发酵过程中碱性蛋白酶活性的影响Fig.5 Influence of F/M on the activity of alkaline-protease

α-淀粉酶可用来间接指示碳水化合物的降解程度。F/M对α-淀粉酶活性的影响及其随时间的变化情况如图6所示。与蛋白酶活性不同，随发酵时间不同，α-淀粉酶活性总体较平稳，但仍受系统F/M的影响。当F/M为1∶1时，α-淀粉酶活性都较高，在发酵时间为144 h时，达14.04 μg maltose/min。较低的F/M条件下，系统中接种酸化污泥提供的产酸微生物数量较多，分泌水解碳水化合物的酶如α-淀粉酶相应增加，对淀粉等碳水化合物的分解能力相应增强。这与之前得出的结论“碳水化合物降解率在F/M为1∶1时达到峰值”相符。α-淀粉酶活性的变化趋势和Zhang等研究高浓度固体有机废物水解过程胞外水解淀粉酶活性变化趋势一致［11］。

图6 F/M对发酵过程中α-淀粉酶活性的影响Fig.6 Influence of F/M on the activity of α-amalyse

2.4 F/M对厌氧酸化产物浓度及分布的影响

厌氧发酵末端产物的分布主要取决于各生态因子综合作用下占主导地位的微生物种群的独立代谢途径，即一旦环境条件适于某一种群，该种群就会迅速占据主导地位，其生理代谢就决定了发酵末端产物的类型［2］。VFA是酸化阶段的主要产物，乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸可直接由碳水化合物及蛋白质发酵获得，更高分子量的挥发性脂肪酸，如正戊酸和异戊酸等主要由蛋白质发酵获得，因为对不含蛋白质的底物进行酸化研究发现，不生成正戊酸和异戊酸［5］。不同F/M条件下，厌氧酸化产物浓度随F/M的影响如图7所示。可见，F/M越高，即底物相对于微生物的含量越高，发酵结束时生成的VFA浓度就越大，发酵产物包括乙醇、乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸、戊酸等，但均以乙酸为主，其次为丙酸和正丁酸。当F/M为1∶0，即未添加酸化污泥时，由于降解有机质的微生物很少，在较短的发酵周期内，VFA产量较低。

图7 F/M对厌氧酸化产物浓度及分布的影响Fig.7 Influence of F/M on the concentration of organic acids and their distribution

Logan等研究发现，乙酸可作为微生物燃料电池的底物产电［12－13］，乙酸还可化学合成醋酸乙烯，醋酸乙烯是合成工业塑料的单体，也可化学合成醋酸纤维素，再进一步转化为乳胶涂料、色素等［14］，是重要的化工原料。因此，通常希望厌氧发酵产生的有机酸以乙酸为主。F/M对乙酸占总末端发酵产物之比的影响如图8所示。与总酸浓度与F/M的相关性不同，在F/M为1∶1时，乙酸占总末端发酵产物比例最高，达82.19%。

图8 F/M对乙酸占总末端发酵产物比值的影响Fig.8 Influence of F/M on the percentage of acetatic acid

另外，除乙酸外，相对于其他有机酸，不同F/M条件下，厌氧产酸过程中均存在明显的丙酸累积现象，F/M为20∶1时，丙酸累积量最高，约为4.00 g/L。在厌氧产甲烷过程中，也常出现丙酸累积现象。有机物的厌氧消化，主要是在水解发酵产酸菌群、产氢产乙酸菌群和产甲烷菌群等不同微生物类群的协同作用下逐步完成的。其中，产氢产乙酸菌群将产酸发酵菌群代谢产生的丙酸、丁酸、乙醇等转化为乙酸、氢气和二氧化碳。然而，从生化反应的能量学角度分析，丙酸的产氢产乙酸代谢是所有VFA厌氧氧化中最难发生的反应，因在标准状态下，丙酸被转化为乙酸反应的吉布斯自由能高达 76 kJ/mol［15］，为正值，不能自发进行，因此，丙酸常在厌氧消化系统中累积［16］。

2.5 F/M对有机酸产量的影响

通常情况下，厌氧发酵结束时，有机酸浓度越高，后提取越容易，提取成本越低。然而，从废物资源化的角度，同时希望原料中的有机物(蛋白质和碳水化合物等)能被最大限度的转化为目标产物，不仅可实现废物的充分减量，同时目标产物的产出率也达到最大。本项研究中，通过调整酱渣预处理液与接种污泥的体积之比调控系统的F/M，并考察其与有机酸产量的关系，因此，所给酱渣预处理液即底物的体积不同。以单位体积底物产酸量折算，所得单位体积末端发酵底物产量及单位体积乙酸产量如图9和图10所示。可以看出，与厌氧发酵产物中有机酸浓度随F/M增加而增大不同，在系统F/M为1∶1时，单位体积末端发酵底物产量及单位体积乙酸产量都是最高的，分别为0.17 g/mL和0.14 g/mL。尽管F/M为50∶1时，最终有机酸及乙酸的浓度最高，但在F/M为1∶1时，有机酸及乙酸的转化率才最大，乙酸在有机酸中的比例也最高。这与各类蛋白酶及α-淀粉酶的活性有关，此时，各类蛋白酶及α-淀粉酶的活性最大，酱渣预处理液中蛋白质和碳水化合物的降解率最高，因此，有机酸特别是乙酸的产率最高。

图9 F/M对单位体积预处理液末端发酵产物浓度的影响Fig.9 Influence of F/M on the yield of total organic acids

图10 F/M对单位体积预处理液乙酸浓度的影响Fig.10 Influence of F/M on the yield of acetic acid

3 结论

(1)当F/M为1∶1时，酱渣预处理液中蛋白质及碳水化合物的降解率最大，分别为71.23%和73.43%。此时，蛋白酶及α-淀粉酶活性也最高，酸性、中性和碱性蛋白酶及 α-淀粉酶的活性分别为5.336 U/mL、3.964 U/mL、4.726 U/mL 及 14.04 μg maltose/min。可溶性蛋白质在发酵初期(2 d内)的转化主要源于酸性蛋白酶的催化降解，酸性蛋白酶的活性对厌氧发酵产酸过程较为关键，之后是中性蛋白酶的催化降解，而在发酵后期(6 d后)，主要依赖碱性蛋白酶的作用。

(2)当F/M为1∶1时，单位体积的酱渣预处理液末端发酵产物的浓度和乙酸浓度均最高，分别为0.17g/mL和0.14g/mL，同时，乙酸占总末端发酵产物比例也最大，为82.19%。发酵产物包括乙醇、乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸、戊酸等，但均以乙酸为主，其次为丙酸和正丁酸。不同F/M条件下，厌氧产酸过程中均存在明显的丙酸累积现象，F/M为20∶1时，丙酸累积量最高，约为4.00 g/L。

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