柿叶总黄酮超声辅助提取工艺研究

孙化鹏，张 珉，钟晓红*

(1.湖南农业大学， 湖南 长沙 410128； 2.湖南省林业科学院, 湖南 长沙 410004)

柿叶总黄酮超声辅助提取工艺研究

孙化鹏1，张 珉2，钟晓红1*

(1.湖南农业大学， 湖南 长沙 410128； 2.湖南省林业科学院, 湖南 长沙 410004)

通过正交试验设计，优选柿叶中总黄酮的超声辅助提取工艺，并对湖南省不同地区、不同品种柿叶原料中总黄酮的含量进行了分析比较。结果表明：超声辅助提取柿叶总黄酮的最佳工艺条件为乙醇浓度60%、料液比1∶50、超声时间30min、超声温度60℃；湖南省不同地区、不同品种的柿叶原料中总黄酮的含量有明显差异，表明品种差异、地区差异以及栽培管理条件都是影响柿叶原料中总黄酮含量的重要因素。

柿叶；总黄酮；超声辅助提取；品种

柿(DiospyroskakiThunb.)，又名朱果、猴枣，为柿树科柿属植物，落叶乔木，是湖南省一种重要的经济树种[1]。柿全身都是宝，有很高的营养价值和药用价值，柿叶、柿果、柿蒂、柿涩汁、柿霜、柿根均可入药[2]。其中，柿叶为柿的新鲜和干燥叶片，味苦、性寒，是一味重要的中药资源，具有很高的药用功效，在临床应用中起到了越来越明显的医疗作用[3-7]。现代研究表明，柿叶药材中黄酮化合物是其主要功能成分[8-10]。从柿叶中提取分离黄酮类化合物，对于柿叶药材应用于现代医药、保健品等领域，具有理论意义和实用价值。另一方面，柿属植物种类繁多，不同品种柿树的叶片中黄酮类化合物的结构和含量都有很大差别。湖南省作为我国柿树原产地之一，地方品种较多，主要是涩柿品种多且为野生散植，但近年来成功引进了多个优良甜柿品种，柿果园栽培面积也在不断发展扩大。优选黄酮类化合物含量高的柿叶原料，炮制成中药材或者应用于提取加工，对提高柿树以及柿果园的综合经济价值具有重要意义[11-12]。我们通过超声辅助提取并设计正交试验条件，对柿叶黄酮类化合物的提取工艺进行优化。同时，调查采集湖南省不同地区、不同品种的柿叶原料，分析比较黄酮类化合物的含量，以期优选出高质量的柿叶药材。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品处理 采集湖南省不同地区不同品种的新鲜柿叶为材料，洗净后置于60℃鼓风干燥箱中干燥至恒重，粉碎后密封备用。正交试验用材料为湖南省长沙市牛心柿柿叶粉末。

1.1.2 仪器和试剂 电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；116摇摆式高速中药粉碎机(浙江永历制药机械有限公司)；电子分析天平(Shimadau公司)；循环水式多用真空泵(上海亚荣生化仪器厂)；超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)。

芦丁对照品(天津尖峰天然产物开发有限公司，纯度≥98%)；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 柿叶总黄酮检测方法 采用硝酸铝—亚硝酸钠比色法测定柿叶中总黄酮含量，原理是铝盐在碱性条件下与黄酮类化合物形成络合物，利用分光光度计在最大吸收波长510nm处测定吸光度值，并根据标准曲线回归方程计算总黄酮含量[13-15]。

1.2.2 芦丁标准曲线的绘制 准确吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL浓度为0.1mg/mL的芦丁对照液分别置于10mL容量瓶中，各加30%乙醇使成5mL，先加5%亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，放置6min，再加10%硝酸铝溶液0.3mL，摇匀，放置6min，再加4%氢氧化钠溶液4mL，用蒸馏水稀释到10mL，摇匀，放置15min，以第一管为空白，在最大吸收波长510nm处测定吸光度，以吸光度值为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线，得线性回归方程：

y=11.363x+0.0019，R2=0.9999。

1.2.3 正交试验设计 选择乙醇浓度、料液比、超声时间、超声温度作为考察因素，按L9(34)设计四因素三水平的正交试验(见表1)，试验重复3次，以柿叶总黄酮的提取率为指标筛选最佳提取工艺。

表1 正交试验因素水平表Tab.1 Thefactorsandlevelsoforthogonalexperiment水平因素A乙醇浓度(%)B料液比(g∶mL)C超声时间(min)D超声温度(℃)1401∶3020402501∶4030503601∶504060

1.2.4 数据处理 试验数据采用SPSS V19.0统计软件进行分析。

1.2.5 湖南省不同地区、不同品种柿叶总黄酮含量分析 精确称取不同品种柿叶样品粉末各1.0g，采用正交试验优选出的最佳工艺条件超声辅助提取，过滤后定容至100mL，即为待测样品溶液，按照1.2.1检测方法检测分析，并计算柿叶总黄酮含量。

2 结果与分析

2.1 柿叶总黄酮超声辅助提取工艺优选

正交试验结果见表2，由表2极差分析可知，影响柿叶总黄酮提取率的主次因素由极差大小确定为：A>B>D>C，即乙醇浓度>料液比>超声温度>超声时间。由表3方差分析可知，乙醇浓度、料液比和超声温度对柿叶总黄酮提取率的影响均达到了显著水平。综合上述试验结果，得出超声辅助提取柿叶总黄酮的最佳工艺条件为：A3B3C2D3，即乙醇浓度为60%、料液比为1∶50、超声时间为30min、超声温度为60℃时，能达到最佳的提取效果。由于A3B3C2D3组合并不在上述正交试验设计之内，需对其进行验证。通过5次重复验证试验，结果表明，其平均提取率为7.524%，RSD=1.60%，表明该最佳提取工艺重现性较好。

表2 正交试验结果及极差分析表Tab.2 Resultsoforthogonalexperiment试验号ABCD吸光度提取率(%)111110.7276.36212220.7476.52313330.8247.18421230.8257.22522310.7926.91623120.8297.23731320.7956.95832130.8387.33933210.8587.50K120.0720.5320.9220.77K221.3620.7721.2420.70K321.7821.9121.0521.74R16.696.846.976.92R27.126.927.086.90R37.267.307.027.25极差R0.570.460.070.35 注:Kn=∑提取率n,n为因素的因子;Rn=Kn/3;极差R=maxRn-minRn。

表3 方差分析结果Tab.3 Resultsofvarianceanalysis方差来源平方和自由度均方F值显著水平A0.50720.25443.355*B0.32720.16327.926*C▲D0.23920.11920.401*误差0.01220.006 注:▲表示空闲因子,*表示显著水平为0.05,**表示显著水平为0.01。

2.2 湖南省不同地区、不同品种柿叶总黄酮含量比较

通过湖南省柿资源调查采样，所采集的17份柿叶样品中(见表4)，引进栽培的甜柿品种主要包括次郎、阳丰、新津20、三代斤等，且均以果园常规方式进行管理；地方品种主要包括腰带柿、盅柿、牛心柿、柿花、甜柿等，且均为散植。根据表4所示数据和图1分析可知，17份柿叶样品总黄酮含量差异明显，其中祁阳县的次郎品种总黄酮含量最高，达到94.28mg/g；而含量最低的是洞口县的腰带柿，总黄酮含量仅为10.92mg/g。综合比较分析，引进栽培的甜柿品种柿叶总黄酮含量远远高于地方品种。进一步分析可知，湖南省同一地区内，不同柿树品种之间柿叶总黄酮含量也有明显差异，如从洪江市采集的样品中，同为引进栽培的甜柿品种，次郎的柿叶总黄酮含量要比阳丰高22.89mg/g；并且同一品种在不同地区之间其柿叶总黄酮含量也有差异，如洪江市的腰带柿样品含量要比洞口县的高出1倍左右。

表4 湖南省不同地区、不同品种柿叶总黄酮含量Tab.4 ThetotalflavonoidcontentofDiospyroskakileav-esfromdifferentvarietyanddifferentregionsinHunanProvince样品编号品种名称采集地总黄酮含量(mg/g)1次郎洪江市94.092阳丰洪江市71.203新津20洪江市88.784贡柿洪江市89.255腰带柿洪江市27.996三代斤祁阳县65.367次郎祁阳县94.288盅柿祁阳县39.359腰带柿祁阳县18.2310腰带柿洞口县10.9211方柿洞口县65.8412柿花溆浦县52.2313柿花辰溪县54.4014膏子柿辰溪县53.8615无核柿桃源县53.9616甜柿桃源县55.9517牛心柿长沙市70.76

图1 17份样品柿叶总黄酮含量比较Fig.1 Comparison of the total flavonoid content of Diospyros kaki leaves from 17 samples

3 结论与讨论

本试验通过正交试验设计确定了超声辅助提取柿叶总黄酮的最佳工艺条件：乙醇浓度为60%、料液比为1∶50、超声时间为30min、超声温度为60℃。在此工艺条件下，柿叶总黄酮的提取率可达7.524%，且该工艺条件稳定性、重现性好，操作简单、省时省力，可以广泛用于柿叶总黄酮含量的分析检测，为筛选高质量的柿叶药材原料奠定了基础。

通过对17份柿叶原料检测得到的柿叶总黄酮含量分析可知，不同地区、不同品种的柿叶原料中总黄酮的含量有着明显的差异，这就表明地区差异和品种差异均是影响柿叶黄酮类化合物含量的重要因素。并且通过进一步分析来看，栽培管理条件好的甜柿品种柿叶原料中总黄酮的含量远远大于野生栽培环境中的涩柿品种，该结果表明柿栽培地的生态环境和栽培条件也是影响柿叶黄酮类化合物含量的重要因素。综上所述，为进一步提高柿园的综合利用价值，获得高质量的柿叶药材原料，要根据不同地区的生态环境和栽培条件优选出适合该地区的最佳品种。

[1] 陈杰忠.果树栽培学各论(南方本)[M]. 北京: 中国农业出版社, 2003.

[2] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典:2010版一部[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2010.

[3] 王燕. 柿叶中黄酮类化合物的研究进展[J]. 亚太传统医药, 2011, 7(4): 173-174.

[4] Sakanaka S, Tachibana Y, Okada Y. Preparation and antioxidant properties of extracts of Japanese persimmon leaf tea (kakinoha-cha) [J]. Food Chemistry, 2005, 89(4): 569-575.

[5] 张胜海, 王英姿, 段飞鹏, 等. 柿叶黄酮磷脂复合物的制备工艺研究[J]. 中草药, 2013, 44(22): 3136-3140.

[6] 马新博, 宫汝飞. 柿叶黄酮药理作用研究进展[J]. 中医药学报, 2012, 40(4): 130-131.

[7] 梁宇红, 陈丽, 吴钢, 等. 柿叶黄酮缓释片的制备及其释放度测定[J]. 中成药, 2013, 35(10): 2134-2137.

[8] 傅建敏, 梁晋军, 周道顺. 柿叶有效成分研究综述[J]. 中南林业科技大学学报, 2013, 33(11): 66-71.

[9] 姜红波, 赵卫星, 冯国栋, 等. 柿叶的主要有效成分及药理作用研究进展[J]. 化工时刊, 2010, 24(6): 38-43.

[10] 周江煜, 李耀华, 侯小涛, 等. 广西产柿叶的HPLC指纹图谱研究[J]. 华西医学杂志, 2011, 26(6): 583-584.

[11] 肖旭, 胡卫健. 柿叶提取物和银杏叶提取物治疗椎-基底动脉供血不足的临床疗效对比[J]. 四川医学, 2012, 33(5): 751-753.

[12] 卫静莉, 薛笑莉, 陈玉章. 提取柿叶黄酮类化合物的工艺研究[J]. 食品研究与开发, 2013, 34(13): 29-32.

[13] 孙化鹏，钟晓红，张珉，等. 超声提取枸杞叶总黄酮的工艺研究[J]. 现代生物医学进展， 2009，19(4)：2645-2648.

[14] 李良导. 皱皮柑果皮中总黄酮的提取、纯化及初步鉴定[D]. 长沙:湖南农业大学, 2008.

[15] 王琴,张洪微,张爱武. 荷叶中黄酮类化合物提取的研究[J].农产品加工, 2011(4):78-80.

UltrasonicextractiontechnologyoftotalflavonoidfromDiospyroskakileaves

SUN Huapeng1, ZHANG Min2, ZHONG Xiaohong1*

(1.Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China;2.Hunan Academy of Forerstry, Changsha 410004, China)

Using orthogonal experimental design, the optimal extraction technology of total flavonoid fromDiospyroskakileaves by ultrasonic was selected, and the total flavonoid content in different varieties ofDiospyroskakiin Hunan Province was studied. The results showed that, the optimal extraction conditions were ethanol concentration 60%, ratio of material to solvent 1∶50, extraction by ultrasonic 30min and temperature 60℃. There was obviously distinction of the total flavonoid content among different varieties ofDiospyroskakileaves and different regions in Hunan Province, which indicated that species difference, regions difference and cultivation management are all the important factors to affect the content of total flavonoid inDiospyroskakileaves.

Diospyroskakileaves; total flavonoid; ultrasonic extraction; variety

2014-06-26

长沙市科技计划项目(K1205012-21)。

*为通讯作者。

TQ 461

A

1003 — 5710(2014)05 — 0018 — 04

10. 3969/j. issn. 1003 — 5710. 2014. 05. 005

(文字编校：张 珉)