荧光原位杂交技术在上尿路的尿路上皮癌诊断中的临床意义

陈松 徐阿祥 孙圣坤 杨淑霞 张旭

1中国人民解放军总医院泌尿外科100853北京

2清华大学附属北京清华长庚医院泌尿外科

上尿路的尿路上皮癌（upper tract urothelial carcinoma，UTUC）如肾盂癌、输尿管癌等是比较少见的泌尿系统恶性肿瘤。虽然UTUC只占全部尿路上皮癌的5%～10%，因其恶性程度高、病程进展快，确诊时大多已浸润周围组织[1]，因此该类病变的早期诊断始终是临床医师及研究人员关注的重要问题。

目前，UTUC的诊断方法主要为尿脱落细胞学检查及输尿管镜检。尿脱落细胞学检查的敏感性较低；而输尿管镜检为有创检查，相当部分的患者因各种原因不能承受。近年来，荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）已愈来愈多地应用于膀胱癌的检测，其敏感性高于尿脱落细胞学检查。作为一项无创检查，FISH在膀胱癌诊断中的重要作用已有大量报道。本研究回顾性分析了中国人民解放军总医院泌尿外科2009～2011年应用FISH所进行的UTUC检测资料，并对其临床意义作进一步阐述。

1 资料与方法

1.1 临床资料

2009～2011年我们对144例疑似上尿路的尿路上皮癌患者进行了FISH检测，病理检查证实阳性病例101例，男59例，女42例，年龄39～84岁，平均62.9岁。其中肾盂癌49例，输尿管癌47例，肾盂合并输尿管癌5例。该检测在输尿管镜检及肾输尿管全长切除手术等有创操作之前进行。全部受检者均行相关的膀胱影像学检查及膀胱镜检，以排除同时合并膀胱肿瘤的可能性。检测所用标本为患者新鲜尿液300ml。患者另有10例为肾细胞癌。

1.2 FISH检测主要试剂及方法

FISH实验所应用的探针由北京金萨嘉公司提供。7、17号染色体着丝粒探针为绿色荧光信号，3号染色体着丝粒探针和杂交到9号染色体长臂（9p21）的P16探针为桔红色荧光信号。所有受试者均于内镜检查前或手术前收集新鲜尿液300 ml送检，按照试剂盒说明书方法进行FISH实验操作。

1.3 判断标准

正常细胞的3、7、17号染色体着丝粒探针及P16探针均为二倍体，在荧光显微镜下观察，细胞核分别可见2个绿色及2个红色信号。出现非二倍体改变即为异常，为FISH检测阳性结果。摄取荧光显微镜下的图像，每组探针分析100～200个细胞。判断标准：判定单体的标准为单个信号的核比例大于15%，3倍体及多倍体的标准为3个及多个信号的核大于10%细胞总数。组合探针阳性参照UroVysion推荐标准：至少在4个细胞中同时存在3、7、17号的2个染色体的扩增，或至少在12个细胞中存在9p21的纯合性缺失。

1.4 组织学检查及结果分析

对输尿管镜活检组织或手术切除标本进行常规HE制片，以组织学病理检查结果作为诊断的金标准，若同一病例出现组织活检病理结果与手术切除标本病理结果不一致时，以手术切除标本病理结果为准。将FISH检测结果与组织病理学结果对照，计算FISH的敏感性与特异性。敏感性＝真阳性／（真阳性＋假阴性），特异性＝真阴性／（真阴性＋假阳性）。其中真阳性指同一病例的病理学结果与FISH检测结果均为阳性；假阳性为FISH检测结果阳性而病理结果阴性；真阴性为FISH与病理结果均为阴性；假阴性为FISH阴性而病理结果为阳性。

2 结果

荧光显微镜下，非肿瘤性脱落细胞的FISH结果显示各探针表现为细胞核内2个红色及2个绿色信号（图1）。尿路上皮癌的尿脱落细胞FISH检测结果显示细胞核内出现多于或少于2个信号的改变，即FISH阳性结果（图2）。在144例疑似患者中，病理诊断尿路上皮癌101例（肾盂癌49例、输尿管癌47例、肾盂合并输尿管癌5例）、尿路上皮良性病变33例。101例尿路上皮癌中，FISH阳性55例、阴性46例；FISH敏感性为54.5%，33例良性病例中，阴性31例、FISH阳性3例；特异性为93.9%。在全部确诊的UTUC病例中，高级别肿瘤56例、低级别21例；浸润性肿瘤60例。高级别中33例FISH阳性，敏感性为58.9%；低级别肿瘤中FISH阳性6例，敏感性28.6%；另有10例病理诊断为肾细胞癌，其中透明细胞癌8例，乳头状肾细胞癌2例；该组病例中，FISH阳性4例、阴性6例（表1）。

图1 非肿瘤性脱落细胞的FISH结果

图2 FISH阳性结果

表1 46例疑似上尿路的尿路上皮癌患者的病理及FISH检测结果 例

3 讨论

尿路上皮癌是常见的恶性肿瘤，其发病率在恶性肿瘤中位于第四位，仅次于前列腺癌（或乳腺癌）、肺癌及结直肠癌。尿路上皮癌可发生于下尿路（膀胱和尿道）以及上尿路（肾盂肾盏及输尿管）。尿路上皮癌中，90%～95%为膀胱癌，膀胱癌是最常见的尿路恶性病变；而上尿路的肾盂癌及输尿管癌较为少见，只占5%～10%。UTUC的发现可为偶发性或因相应症状而得以诊断。70%～80%的UTUC病例最常见症状为肉眼血尿或镜下血尿。与膀胱癌的自然病程明显不同，UTUC临床确诊时60%的病例已具有浸润性，而仅有15%～20%的膀胱癌发生上述改变[1]。因此，为及时制定适宜的治疗方案，UTUC的早期诊断、病变分期及预后的正确评估具有非常重要的临床意义。

目前，UTCU的诊断主要依靠尿脱落细胞学检查和输尿管镜查。2013年最新版欧洲上尿路的尿路上皮癌诊断指南中，尿脱落细胞学检查和CT尿路造影（CT urography，CTU）被列为A级建议，诊断性输尿管镜检及活检和逆行肾盂造影被列为C级建议[1]。然而，UTUC是一种复杂的异质性肿瘤，涵盖了从分化良好的浅表性病变到分化极差的浸润性病变的多种病理变化，各类异常病变之间相差甚远。因此，上述诊断措施无法对UTUC提供完全准确可靠的诊断依据，同时，在实际临床应用中均存在着不同程度的缺陷。以尿脱落细胞学检查为例，其敏感性较低，对于尿路上皮癌总敏感度为20%～30%[2]。同样，作为有创操作，输尿管镜检查不仅给患者造成痛苦甚至出现严重并发症，而且往往无法发现扁平状病变及原位癌[3，4]。此外，影像学检查中的 CTU 等项目，由于受患者肾功能变化、肿瘤形态及大小等诸多因素的限制，亦不能单独作为UTUC的诊断工具。

FISH是一种细胞遗传学技术，可通过检测尿脱落细胞的3、7、9、17号染色体数目异常用于UTUC的诊断。因其尿路上皮癌敏感性以及不同分期分级的尿路上皮癌敏感性均明显高于传统细胞学检查，已被美国食品和药品管理局（FDA）批准，将其UroVysion试剂盒用于膀胱癌诊断和术后复发监测、肉眼及镜下血尿原因的筛查。目前，FISH技术已日趋广泛地应用于膀胱癌的诊断中[2，3]。细胞遗传学研究表明，UTUC的染色体核型的异常改变与膀胱癌相同[5]，这为FISH检测UTUC提供了理论基础。Marín-Aguilera等[3]及Akkad[6]较早将FISH技术用于 UTUC的研究。前者所入选的30例UTUC患者中，FISH阳性23例，敏感性为76.7%，特异性为94.75%；而尿脱落细胞学的敏感性为36%，特异性为100%。后者发现FISH的UTUC敏感性为87.5%，细胞学则为60%，但FISH和尿脱落细胞学检查的特异性均为80%。近年来不断有研究显示FISH的UTUC敏感性明显高于普通的尿脱落细胞学检查，甚至其敏感性高达85%～100%，而尿细胞学检查的结果仅为21%～24%[7，8]。此外，Xu等研究发现，联合应用FISH和尿脱落细胞学检查无论对于浸润性或非浸润性肿瘤，均可使诊断UTUC的敏感性有单独应用FISH的79%提高到86%[9]。

本研究的101例UTUC病例中，高级别肿瘤56例，占总数的55%。浸润性肿瘤60例，占全部病例的59%，这与文献[1，3]报道的 UTUC多位高分级和高分期的结论相似。本组应用FISH检测UTUC的敏感性为54.5%，特异性为93.9%。与上述相关研究结果[3，6～9]比较，本组 FISH 的特异性与上述报道一致，但FISH的敏感性较低。考虑本组FISH敏感性的差异可能与与下列因素有关：①相对上述各组实验数据，虽然本组是例数最大的样本，但本组病例多数为疑难病历，典型的UTUC例数较少。推测若将典型病例行FISH检测，敏感性可能会有所提高；②因经济因素以及患者依从性的差异等实际困难因素，本组所有受试患者只留取了一次尿液标本，收集到肿瘤脱落细胞的概率相应减小，因此可能导致FISH敏感性降低；③FISH敏感性与肿瘤病理分级呈正相关。本组FISH总的敏感性为54.5%；在56例高级别病例组中，33例呈FISH阳性，敏感率为58.9%，略高于本组总敏感率；而在21例低级别组中，敏感率仅为28.6%。

在 Xu等[9]的研 究中，FISH 对于高级 别UTUC的敏感性为90.6%，低级别的敏感性为69.2%。Marín-Aguilera等的研究结果与Xu相似，在其高级别UTUC病例组中，FISH的敏感性为86.4%，低级别组为50%[3]。上述FISH 敏感性在高级别与低级别UTUC的变化情况与本组的实验结果相符。此外，上述研究显示，在同一分期和同一分级的病变中，FISH的敏感性均明显高于尿脱落细胞学检查。因已知尿脱落细胞学诊断UTUC的敏感性较低，本组实验未行该项检查并与FISH进行比较。

此外，本研究经病理证实的10例肾细胞病例中，FISH阳性4例，其中2例为透明细胞癌、另外2例为乳头状肾细胞癌，由此可推测FISH阳性并非为尿路上皮癌所特有。Reid-Nicholson等[10]认为，肾细胞癌的某些染色体异常变化与尿路上皮癌存在相同之处，当肾细胞癌侵犯肾盂进入到集合系统之后，可通过FISH技术检测尿液中脱落的癌细胞已达到诊断目的，在其进一步的研究中，将39例肾细胞癌的蜡块组织进行FISH检测，发现15例（40%）FISH阳性，其中包括透明细胞癌、乳头状细胞癌、嫌色细胞癌以及肉瘤样癌。FISH所检测的是染色体异常的变化，无法观察细胞形态学的变化，因而不能鉴别尿路上皮癌与肾细胞癌，亦无法判定肿瘤细胞的分期和分级。除肾细胞癌之外，膀胱的非尿路上皮癌如鳞癌、原发或继发性膀胱腺癌亦可呈FISH阳性变化[11]。FISH的这一特征提示病理医师及泌尿外科医师发现尿脱落细胞FISH阳性时，不应只将解释为尿路上皮癌，同时要注意非尿路上皮肿瘤的可能性，这将对治疗方案的实施具有重要意义。

再有，在较少见情况下，UTUC可以合并原位癌，尿路上皮原位癌可使UTUC的复发率增高并促进病情发展[12]。Pieras等[13]发现，UTUC患者肾输尿管全长切除术后膀胱癌的发生与合并上尿路的尿路上皮原位癌有关。Wheat等[14]通过分析行肾输尿管全长切除术的患者资料发现，合并上尿路原位癌者术后复发率及肿瘤特异性死亡率均明显增加。Youssef等[15]亦证实，既往有膀胱原位癌病史更易发生恶性程度较高的UTUC，而且行肾输尿管全长切除术后肿瘤复发率及肿瘤特异性死亡率均较高。以上研究表明，尿路上皮原位癌与UTUC的预后密切相关，对于既往有膀胱原位癌病史的患者，更应密切随访，筛查上尿路原位癌及UTUC。文献报道，尿脱落细胞学检查膀胱原位癌的敏感性为66%～83%[16]，而相应一系列研究发现，FISH的尿路上皮原位癌敏感性明显高于尿脱落细胞学[17，18]。同时，FISH检测尿路上皮癌蜡块组织亦有较高的敏感性[19]。上述作者认为，FISH有望成为辅助尿脱落细胞学及组织活检诊断尿路上皮原位癌的另一个重要手段。

本实验所选病例均为临床上复杂的疑难病例，所有全部病例的FISH检测均因临床工作中的实际需要而实施，典型的UTUC病例未入组，实验结果可能会存在一定的偏差，FISH敏感性低于其他研究组，对于单纯评价FISH敏感性而言，这是本研究的不足之处。今后可将典型病例一同纳入并与本组结果做进一步比较。

总之，FISH作为一项无创检查，因其较高的特异性以及优于尿脱落细胞的敏感性，已成为诊断上尿路的尿路上皮癌的重要手段。同时，FISH对于尿路上皮原位癌以及肾细胞等非尿路上皮癌的敏感性，有可能为实际临床工作对于复杂UTUC的诊断、鉴别诊断以及相应治疗方案的制定提供新的思路和方法。

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