PIAS-1基因真核表达质粒的构建与鉴定

秦会影，王海琳，刘 钰，张 培

(1.兰州大学第一临床学院妇科，甘肃兰州，73000;2.甘肃省人民医院妇科，甘肃兰州，73000)

RNA干涉(RNAi)由美国科学家Andrew Fire和Craig Mello［1］于1998年正式提出，其原理为利用同源性的双链RNA(dsRNA)诱导序列特异性的目标基因的沉寂，迅速阻断基因活性。siRNA起决定作用，是对特定信使RNA(mRNA)进行降解的指导要素［2－3］。细胞因子是一类能够传递细胞信息，介导和调节免疫、炎症反应的小分子多肽［4］，Jak-stat通路是一条重要的介导细胞因子信号转导的通路，在细胞因子信号转导中有决定意义。而Jak-stat在发挥其信号转导的同时也启动了该途径的负反馈性抑制环路，从而调节Jakstat通路动态平衡［5－6］。Stat活化抑制蛋白 PIAS可直接结合并抑制stat蛋白［7］，通过影响stat蛋白磷酸化而改变JAK-STAT通路［8］。相关研究表明，多种肿瘤均存在JAK-STAT的异常表达，且和肿瘤的侵袭转移、血管生成、耐药及预后有关。为此，该实验通过以siRNA为工具，以Plko.1作载体，以人源PIAS-1为模板，构建Plko.1-PIAS-1重组质粒，为肿瘤治疗的研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 主要材料与试剂

载体质粒 Plko.1、大肠杆菌DH5a由兰州大学结核病研究中心保存;质粒小提及无内毒素大提试剂盒、胶回收纯化试剂盒、限制性内切酶Age1酶、DNA makerⅣ购自北京天根生化科技有限公司;T4连接酶、限制性内切酶EcoR1酶、T4连接酶、pfu酶、2×Premix酶、6×loading buffer购自大连Takara有限公司;恒温摇床、高压蒸汽锅、湘仪离心机、低温离心机beckman、水浴锅、PCR仪、冰盒。

1.2 方法

1.2.1 引物设计并退火:人源的PIAS-1基因位点为 NM-016166.1，CDs区 97-2052，pLKO.1 质粒酶切位点为AgeⅠ，EcoRⅠ，据siRNA设计原则，载体特点，设计上游引物为5'-CCGGAAGCAAATGGTTATGAGCCTTCTCGAGAAGGCTCATA ACCATTTGCTTTTTTTG-3'下游引物为:5'AATTCAAAAAAAGCAAATGGTTATGAGCCTTCTCGAG AAGGCTCATAACCATTTGCTT-3'，由 大 连 Takara有限公司设计并合成。将引物稀释为0.010D/μL，按以下体系将上下游引物退火形成双链即shRNA Oligos，上下游引物各1μL、退火Buffer 1μL、ddH2O 7μL，其中退火 Buffer:10 mM Tris pH 8.0，50 mM NaCl，1 mM EDTA，于94℃5 min，30℃ 90 min然后冷却至室温(约1 h)，将冷却后产物置于4℃保存。

1.2.2 质粒扩增及酶切:① 质粒扩增:将质粒转化至过夜的感受态细胞中，提取质粒核酸电泳验证;② 质粒酶切:AgeⅠ及EcoRⅠ分别预酶切，10 ×buffero 2μL，质粒 DNA 1μL，酶(AgeⅠ/EcoRⅠ)1μL，加水补足20μL体系，37℃，4h，均可切开;遂双酶切:质粒 DNA 10μL，AgeⅠ酶和 EcoRⅠ酶各 1μL，10 ×buffero 2μL，加水补足20μL，37℃，4h，核酸电泳显示两条条带即7.000 bp和1.900 bp，双酶切成功，遂使用双酶切进行大量酶切，并将酶切产物胶回收纯化。

1.2.3 重组质粒构建:将 shRNA Oligos及Plko.1酶切产物按以下体系连接:10×T4DNA Ligase buffer 1.5μL，T4DNA Ligase lμL 质粒DNA 酶切产物5.5μL，shRNA Oligos12μL，16 ℃，连接过夜(12～16 h)，以siRNA为引物，将连接产物进行 PCR 检测，体系:重组质粒 0.5μL、2 ×Premix酶10μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL，加水 8.5μL 补足 20μL，94 ℃ 5 min、94℃ 30 s、50℃ 30 s、72℃ 30 s、72℃ 7 min 4℃保存。并送大连Takara测序。

2 结果

质粒pLK 0.1长度为8901 bp，质粒浓度较高，核酸电泳图未见明显杂带，见图1。质粒分别经AGE1和EcoR1酶切，后经琼脂糖凝胶电泳检测到大小约为7000 bp、1900 bp的2个片段，见图2。将引物与重组质粒PCR检测证明pLK 0.1-PIAS-1构建成功，见图3。将重组质粒送大连Takara测序，测序图谱见图4。测序结果与Gen-Bank上公布的基因序列完全一致，经测序验证，成功构建了PIAS-1 siRNA干扰载体Plko.1-PIAS-1，并测序鉴定克隆正确，见图4。

图1 质粒pLK 0.1质粒胶回收纯化

图2 质粒pLK 0.1双酶切图，条带2为正确酶切图

图3 PCR产物图

图4 测序截图

3 讨论

宫颈癌是妇科第2大恶性肿瘤，发展中国家发病率呈上升趋势，并且近些年有较明显年轻化趋势。由于女性生育的平均年龄延迟，使宫颈癌患者对治疗后生活质量有了更高要求，特别是要求保留生育功能和内分泌功能;另一方面，中国宫颈癌中晚期患者多，除传统放疗和手术外，还有化疗的治疗。最近越来越多的研究指向在人类癌症中起着关键作用的JAK-STAT通路，不论从分子结构、调控机制还是功能研究均取得了丰硕的成果，该通路对细胞内细胞因子的活动是必需的，其发挥信号转导同时也启动了该途径的负反馈性抑制环路，从而使jak-stat通路的活动得到平衡与控制［9］。JAK-STAT由多种不同途径和机制共同调节，Stat活化抑制蛋白PIASs作为JAK-STAT信号通路的激活抑制因子最近也成为研究的热门。PIASs家族包括PIAS1，PIAS3，PIASx，PIASy［10］，在基因转录、细胞信号通路、细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、机体的免疫应答以及肿瘤的发生发展等过程中均发挥重要作用，尽管在序列上具有高度同源性，但不同的家族成员在生物体中的作用不尽相同，PIASs可能含有锌结合基序和高度酸性区，可直接结合并抑制stats蛋白。研究证实，PIASs能专一性结合活化的stat1，并通过直接抑制stat与DNA的结合和转录活性而起作用。PIAS1一方面可通过对STAT1的抑制对机体的炎症及免疫反应起负调节，同时PIAS1还 能提高某些病毒如人乳头瘤病毒、巨细胞病毒的致病性，这一作用是PIAS1通过炎性介质IFNγ等而发挥作用的［13］。大量研究［11－14］表明，STAT1 对肿瘤有抑制作用，已在多种肿瘤组织如乳腺癌、头颈部肿瘤、黑色素瘤、白血病等发现STAT1的活性异常甚至表达缺失，其活化抑制因子PIASs也在相应的肿瘤组织中高表达，如前列腺、子宫颈及子宫内膜等，且与妇科肿瘤的关系也备受关注。因此，该基因有可能成为新治疗靶点来协助肿瘤治疗。PIAS-1是否在宫颈癌细胞株中表达上调，引起化疗药物对宫颈癌细胞的敏感性下降，临床治疗中对PIAS-1上调的患者是否应该加大化疗药物的剂量及化疗药物种类，尚需进一步研究。阻断恶性肿瘤JAK-STAT通路中的负性调节因子，有望在治疗恶性肿瘤中占有一席之地。目前对PIAS-1研究的意义不仅是阐述一种生理现象，更重要的是希望找到肿瘤发生发展的相关机制，找到肿瘤预防和治疗的有效途径。因此，本试验成功构建了PIAS-1的真核表达载Plko.1-PIAS-1，以期为肿瘤的生物治疗及肿瘤细胞JAK-STAT相关机制的研究提供物质基础。本试验根据PIAS-1全基因组序列设计PIAS-1 siRNA的特异性引物序列，通过酶切连接、PCR及测序分析成功构建了pLK0.1-PIAS-1真核表达载体，为研究PIAS-1在肿瘤中的作用和与宫颈癌细胞化疗间的相关性做好准备，PIAS-1可能成为宫颈癌分子靶向治疗的一个靶点。pLK 0.1是U6启动子，为RNA聚合酶Ⅲ启动子的一种，而RNA聚合酶Ⅲ是siRNA载体在哺乳动物细胞中表达活性的必需中间介质;pLK 0.1还带有氨苄霉素和嘌呤霉素抗性基因、多克隆位点，可确保外源基因有效的转录和表达［15］;pLK 0.1 与 psPAX2、pMD2.G 借助 293t细胞可形成慢病毒，是后期稳转株筛选的必备条件。但本试验的局限性在于:只成功构建了含有目的基因PIAS-1的慢病毒载体Plko.1-PIAS-1，未转染宫颈癌细胞系进行进一步的研究，因此只停留在基因水平，尚未进行功能上的试验及研究。

［1］Zeng M，Kuzirian MS，Harper L，et al.Organic small hairpin RNAs(OshR):A do-it-yourself platform for transgene-based gene silencing［J］.Methods，2013.63(2):101.

［2］Shah JK，R Garner H，White MA，et al.sIR:siRNA Information Resource，a web-based tool for siRNA sequence design and analysis and an open access siRNA database［J］.BMC bioinformatics，2007，8:178.

［3］Cheng P，Ni Z，Dai X，et al.The novel BH-3 mimetic apogossypolone induces Beclin-1-and ROS-mediated autophagy in human hepatocellular carcinoma correctedcells［J］.Cell death＆ disease，2013，4:e489.

［4］Lopez TV，Lappin TR，Maxwell P，et al.Autocrine/paracrine erythropoietin signalling promotes JAK/STAT-dependent proliferation of human cervical cancer cells.International journal of cancer［J］.Journal international du cancer，2011，129(11):2566.

［5］叶明珠.信号传导和转录激活因子1及其抑制子PIAS1在Ⅰ期及Ⅱ期宫颈鳞癌中的表达及意义［J］.中国实用妇科与产科杂志，2010，26(11):837.

［6］Caraglia，M，M Marra，G Pelaia，et al.Alpha-interferon and its effects on signal transduction pathways［J］.Journal of cellular physiology，2005，202(2):323.

［7］Sobti R C，Singh N，Hussain S，et al.Overexpression of STAT3 in HPV-mediated cervical cancer in a north Indian population［J］.Molecular and cellular biochemistry，2009，330(1/2):193.

［8］Ferrandi C，Richard F，Tavano P，et al.Characterization of immune cell subsets during the active phase of multiple sclerosis reveals disease and c-Jun N-terminal kinase pathway biomarkers［J］.Multiple sclerosis，2011，17(1):43.

［9］Sobti R C，Singh N，Hussain S，et al.Aberrant promoter methylation and loss of suppressor of cytokine signalling-1 gene expression in the development of uterine cervical carcinogenesis［J］.Cellular oncology，2011，34(6):533.

［10］Saydmohammed M，Joseph D，Syed V.Curcumin suppresses constitutive activation of STAT-3 by up-regulating protein inhibitor of activated STAT-3(PIAS-3)in ovarian and endometrial cancer cells［J］.Journal of cellular biochemistry，2010，110(2):447.

［11］Liang Y，Jin Y，Li Y.Expression of JAKs/STATs pathway molecules in rat model of rapid focal segmental glomeruloscle-rosis［J］.Pediatric nephrology，2009，24(9):1661.

［12］Sentis S，Romancer M L，Bianchin C，et al.Sumoylation of the estrogen receptor alpha hinge region regulates its transcriptional activity［J］.Molecular endocrinology，2005，19(11):2671.

［13］Ferrandi C，Richard F，Tavano P，et al.Characterization of immune cell subsets during the active phase of multiple sclerosis reveals disease and c-Jun N-terminal kinase pathway biomarkers［J］.Multiple Sclerosis Journal，2010，17(1):43.

［14］Hoefer J，Schafer G，Klocker H，et al.PIAS1 is increased in human prostate cancer and enhances proliferation through inhibition of p21［J］.The American journal of pathology，2012，180(5):2097.

［15］Buitrago C，Pardo V G，Boland R.Role of VDR in 1alpha，25-dihydroxyvitamin D3-dependent non-genomic activation of MAPKs，Src and Akt in skeletal muscle cells［J］.The Journal of steroid biochemistry and molecular biology，2013，136:125.