不同比例利多卡因-布比卡因混合液鞘内注射后大鼠神经行为及脊髓神经结构变化

赵广翊，赵柏松，高林林，丁旭东

(中国医科大学附属盛京医院麻醉科，辽宁沈阳，110004)

布比卡因与利多卡因分别是临床最常用的酰胺类长、中等时效局麻药，常将二者混合使用以达到起效快，麻醉时效长的目的。有研究观察:2种局麻药作用于坐骨神经［1］、感觉神经元［2］、脊髓后根神经节细胞［3］的体外研究，以及通过鞘内注射高浓度局麻药观察动物的神经行为学及组织病理学改变的动物实验研究［4－5］发现，利多卡因较布比卡因能产生更为严重的神经功能缺失及组织病理学改变。也有研究［6］表明，其机制可能在于利多卡因过度激活中枢神经系统谷氨酸受体产生神经毒性作，大量临床资料亦表明利多卡因的TNS等椎管内麻醉后的神经系统并发症的发生率高于布比卡因，两种局麻药混合液的配伍比例不同是否对其脊髓神经毒性产生影响，以及何种配比比例可减轻神经毒性反应鲜有报道。本研究将10%盐酸利多卡因与2.5%盐酸布比卡因按不同的配比混合后鞘内注射，观察大鼠的神经行为及脊髓神经结构的变化，以期对二者混合液的脊髓神经毒性有进一步的了解。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

雄性清洁级SD大鼠，体质量260～300 g，由中国医科大学实验中心提供，实验动物饲养在(25±5.0)℃、正常昼夜规律、避强光、噪音刺激的环境中，动物可自由进食、进水。选择鞘内置管成功大鼠48只随机分为6组(n=8)，S组:0.9%NS;LB13 组:2.5% 利多卡因 +1.875% 布比卡因;LB12组:3.33%利多卡因+1.67%布比卡因;LB11组:5%利多卡因+1.25%布比卡因;LB21组:6.67%利多卡因 +0.83%布比卡因;LB31组:7.5%利多卡因+0.625%布比卡因。所有药液均由微量注射器以约10μL/15 s的速度推注，将10%盐酸利多卡因与2.5%盐酸布比卡因按药液容积比 1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1混合后配制局麻药混合液。分别按组别进行鞘内注射，各组均注药液20μL，注药后用10μL生理盐水冲洗导管。

1.2 仪器及设备

微量注射器购自瑞士Hamilton公司。BME-410 C型全自动热痛刺激仪购自中国医学科学生物医学工程研究所。von Frey细丝购自美国Stoelting公司。PE-10导管购自宁波安来公司。11800修块机和8800超薄切片机购自瑞典LKB公司。透射电镜JEM-1200EX购自日本电子公司。

1.3 试剂及药品

盐酸利多卡因与盐酸布比卡因购自sigma公司。多聚甲醛粉末购自天津市化学试剂研究所。10%水合氯醛溶液购自中国医科大学盛京医院药剂科。25%戊二醛购自国药化学试剂有限公司。0.9%生理盐水购自Baxter制药。青霉素钠80万/支购自华北制药股份有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 动物模型:按参考文献［7］鞘内置入 PE-10导管尖端至骶1水平。腹腔注射10%水合氯醛(300～350 mg/kg)麻醉，大鼠取俯卧位，于脊柱下段两侧可触及一对钝形突起(髂结节)，其水平连线为大鼠L6水平，剪毛、碘附消毒，于背部正中线L4～5间隙处作长约2 cm的皮肤纵切口，切开筋膜，钝性分离L4及L5棘突周围肌肉，暴露L4～5棘突间隙，切除部分L4～5棘突，暴露上、下关节突间黄韧带，持弯钳提起下位棘突用PE-10导管尖端穿破黄韧带及硬脊膜，以鼠尾突然出现侧摆或后腿抽动为成功标志。于显微镜下经硬脊膜破口向尾侧插入PE-10导管2 cm，可见导管内充盈清亮的脑脊液，大鼠蛛网膜下腔置管成功后，固定、缝扎导管，0.9%生理盐水10μL冲洗导管，防止血栓堵塞，导管尾端加热熔闭管腔，防止脑脊液外溢，导管埋于皮下，缝合切口，术毕肌注青霉素钠，白炽灯照射保温至大鼠苏醒。大鼠单笼饲养3 d，每日检查有无脊髓神经损伤及局部感染表现。术毕第3天鞘内注入1%利多卡因20μL，30 s之内出现双下肢瘫痪者为利多卡因筛选试验阳性，如钳夹双上肢躲避反射存在，而双下肢无反应，夹尾反射消失，则选入实验，术毕出现四肢瘫痪、活动障碍及利多卡因试验阴性或出现单侧肢体瘫痪者排除出实验。

1.4.2 神经行为学实验:参照文献［8］方法对大鼠神经行为学的改变进行测试:①鼠尾热痛阈值的测定(TFL):将大鼠放在玻璃板上，大约10 min，使其恢复安静开启热痛刺激仪的卤素灯作为热辐射光源，照射鼠尾中后3、5、7cm处，记录从热源启动到大鼠甩尾的时间作为甩尾反应潜伏期，测量间隔时间为5 min，取其平均值作为痛阈值。切断时间设定为12 s，如果在12内大鼠无甩尾反应，则终止热辐射甩尾实验，以防大鼠尾部皮肤造成损伤。实验中若大鼠甩尾反应潜伏期大于12 s其TFL值均记录为12 s;② 爪机械性痛阈测定(PWT):机械性痛敏采用von Frey细丝测定。将大鼠置于金属网上，盖以透明的有机玻璃罩内，先让大鼠适应环境30 min，待大鼠的梳理和探究活动基本消失后，用一系列标准化的 von Frey纤维按照一定的顺序刺激大鼠后肢足底中部，直至弯曲稍成S形，持续6～8 s，观察是否出现缩足反应。当弯曲到90°大鼠仍然不抬足，视为无反应;更换相邻稍大压力的纤维细丝，大鼠在刺激时间内或在移开von Frey纤维时立即出现快速的缩足反应，记为阳性反应，直到找到一个纤维细丝，用其连续测试5次中有3次阳性反应，认为其为阈值(g)，最高阈值设为50 g。而身体活动所引起的缩足反应不记作阳性反应，前后2次不同刺激间隔10 s。TFL及PWT分别于鞘内注射后1、2、3、4 d的上午进行观察;③ 后腿运动恢复时间的测定:分别于每次注药后10、30 min，1、2、3、4h 及注药后 1、2、3、4 d 的上午进行观察，并记录双后腿回复至正常的时间，数据采用中位数时间(最短时间－最长时间)表示。

1.4.3 标本制备:各组大鼠均于鞘内注射后第4天，行最后一次神经行为学评测后，腹腔注射10%水合氯醛溶液300～350 mg/kg麻醉后迅速开胸，暴露心脏，行左心室插管灌注，右心耳剪开放血先以37℃的0.9%生理盐水300 mL冲灌，直至体循环血液冲洗干净，流出清亮的灌流液为止。4%多聚甲醛 －2.5%戊二醛PBS液(0.1 mol/L，pH 7.35)500 mL 灌流固定。每只鼠选取脊髓尾段(脊髓圆锥以上10 mm)、马尾神经(脊髓圆锥以下10 mm)进行分析。

1.4.4 脊髓病理损伤评分:所有标本采用单盲法，参照文献［9］的方法进行视觉评分。圆锥近端(脊髓尾段)10 mm的切片被用作定性评估，圆锥远端10 mm的切片被用作神经损伤的定量分析。横切面视野的每一神经束用0～3分评定损伤程度:0分，神经纤维无水肿及损伤;1分，神经纤维水肿可伴有变性或脱髓鞘改变;2分，＜50%神经纤维变性或脱髓鞘改变;3分，＞50%神经纤维变性或脱髓鞘改变。并随机选取3个横切面视野，计算各神经束损伤评分的均值。

1.4.5 脊髓组织形态改变光学显微镜观察:脊髓组织置于4%多聚甲醛PBS液中固定4h，固定后置入脱钙液中24h，行石蜡包埋组织切片，尾段脊髓及马尾神经标本做脊髓组织水平面切片，片厚4μm。分别行苏木素-伊红(HE)染色及甲苯胺蓝染色，于光学显微镜下观察。①HE染色:切片用自来水洗片刻，蒸馏水洗片刻，苏木精浸染1～2min，自来水冲洗片刻，1%盐酸酒精分化3～5s，自来水冲洗数分钟至数小时，1%的氨水分化3～5 s，自来水冲洗数分钟至数小时，蒸馏水冲洗片刻，85%的酒精脱水10min，95%的酒精脱水10 min，0.5%的伊红溶液浸染1～2 min，脱水(95%、100%、100%的酒精各10 min)，透明(二甲苯10 min，3次)，中性树胶封固，观察;② 甲苯胺蓝染色:石蜡切片常规脱蜡至水;滴加1%甲苯胺蓝液染色5 min;蒸馏水洗;95%乙醇急速分化;脱水(95%、100%、100%的酒精各10min)，二甲苯透明，中性树胶封固，观察。

1.4.6 脊髓后角白质马尾神经超微结构的电镜观察:另取尾段脊髓组织，在冰面上经20倍手术显微镜放大，切取1 mm脊髓后角白质组织，迅速投入2.5%戊二醛磷酸缓冲固定液中送电镜检查。标本经2.5%戊二醛前固定后，0.1 MPBS(磷酸缓冲液)漂洗3次，10～15 min/次，1%四氧化锇后固定1 h，OAMPBS漂洗3次。丙酮逐级脱水(50% ～70% ～90% ～100%)，Epon812包埋剂与100%丙酮1∶1比例浸泡2～3 h，纯Epon812包埋剂浸泡2 h。修块定位，切取超薄切片，枸橼酸铅、醋酸双氧铀双重染色后电镜观察。

1.5 统计分析方法

所有数据应用SPSS 18.0统计学软件进行统计处理。计量资料符合正态分布的以均数±标准差表示。TFL、PWT及脊髓标本病理损伤评分应用单因素方差分析(ANOVA)，组间比较采用Scheffé and Dunnett tests.大鼠后肢行走恢复时间应用Kruskal-Wallis检验，组间比较用Mann-Whitney U-test。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经行为学改变

S组MEP%和PWT在各时点无明显变化。LB31组注药后1～4 d的MEP%与同时点其他各组比较明显升高(P＜0.05)。注药后1～4 d各组大鼠同时点PWT比较无统计学差异(P＞0.05)。见表1。

表1 各组大鼠TFL最大效应比(MEP%)与PWT各时点的变化

2.2 病理损伤评分及运动功能恢复情况

各组大鼠病理损伤评分比较发现LB21组、LB31组的病理损伤评分较其他各组明显增加(P＜0.05)。LB31组大鼠后肢运动功能恢复时间较其他各组显著延长(P＜0.05)。见表2。

2.3 脊髓组织形态改变光学显微镜观察

除S组以外的各组均出现不同程度的病理改变。LB13组、LB12组、LB11组的病理损伤相近，表现为马尾神经纤维局灶水肿，LB21组出现局灶的脱髓鞘改变，LB13组、LB12组、LB11组及LB21组脊髓后角白质结构大致正常。LB31组见马尾神经纤维较严重的脱髓鞘变性，伴脊髓后角白质水肿。见图1，2。

表2 各组大鼠病理损伤评分及运动功能恢复时间的比较

图1 脊髓组织形态改变光学显微镜观察 HE 400倍

图2 脊髓组织形态改变光学显微镜观察 甲苯胺蓝 200倍

2.4 脊髓组织超微结构的电镜观察

S组显示脊髓后角白质组织超微结构正常，有髓神经纤维的髓鞘完整，轴索结构正常。LB13组、LB12组、LB11组见部分有髓神经纤维的板层结构疏松，局灶轴索与髓鞘分离，有髓神经纤维肿胀，无髓神经纤维轮廓清晰。LB21组、LB31组见大部分有髓神经纤维的板层结构疏松，轴索与髓鞘分离，无髓神经纤维模糊不清。见图3。

图3 大鼠脊髓组织超微结构观察 8000倍

3 讨论

椎管内麻醉时为达到更好的麻醉效能，充分利用不同局麻药的优点，常常将中长效局麻药混合使用以达到起效迅速、维持时间长的目的，因此局麻药的脊髓神经毒性成为麻醉学及疼痛治疗学领域关注的重点。Drasner等［10］向鼠蛛网膜下腔分别输注相同容量的临床常用浓度的利多卡因、布比卡因，观察感觉损害程度;Yamashita等［11］通过兔的蛛网膜下腔单次注入地卡因、布比卡因、利多卡因和罗哌卡因，观察脊索空泡范围:这些实验结果表明，利多卡因的脊髓神经毒性强于布比卡因，大量的临床回顾性及前瞻性研究亦证实利多卡因脊麻后的神经并发症的发生率要高于布比卡因。本研究结果表明:除NS对照组外，各组大鼠鞘内注射10%利多卡因与2.5%布比卡因混合液后，脊髓组织均出现了不同程度的病理改变，其中LB31组的病理改变较重，马尾神经及尾段脊髓的后角白质均出现水肿及脱髓鞘变性，同时注药后1～4 d的TFL延长，并出现后腿运动恢复时间的异常延长;LB21组病理损伤较轻，表现为马尾神经的局灶水肿脱髓鞘，脊髓后角白质未见明显的病理改变，无明显神经行为学变化;LB13组、LB12组、LB11组的病理损伤较轻微，TFL在鞘内注药后第1天均恢复至基础值水平。Capdevila等［12］报道40640例施行脊麻的病例中有24例发生神经障碍性并发症，其中2例是在2%利多卡因单次脊麻后发生的马尾神经综合征，且在腰穿过程中都没有出现异常感觉和疼痛。提示:局麻药本身与马尾神经综合征的发生有较强的相关性。Beardsley等［13］对12名自愿者用利多卡因100 mg施行脊麻后，出现1例延迟性会阴部感觉障碍。高浓度的利多卡因进行蛛网膜下腔阻滞后会引起一过性神经症状或持续性鞍区感觉缺失，故临床上不推荐使用5%以上浓度的利多卡因用于蛛网膜下隙麻醉。另有报道，应用单纯利多卡因等比重或重比重液或以脑脊液稀释行蛛网膜下间隙阻滞，术后 TNS 的发生率为 1∶7［14－16］。布比卡因临床上蛛网膜下间隙阻滞麻醉后神经系统并发症的报道相对较少，鲜有永久性的神经功能缺失的报道，仅见少量的TNS的报道，其中Eberhart等［17］证实利多卡因、布比卡因脊麻后TNS发生率分别为16.9%，1.1%。本实验中，将10%利多卡因与2.5%布比卡因按不同容积比混合鞘内注射，发现随着混合液中利多卡因浓度的增加布比卡因浓度的降低，病理损伤评分出现了增高的趋势，我们推测利多卡因与布比卡因混合液的神经毒性的变化可能与药液中利多卡因的绝对浓度有关。本实验结果表明:LB21组、LB31组脊髓组织的病理损伤较重，而LB11组、LB12组、LB13组的病理损伤较轻，且未出现明显神经行为学的变化，故我们认为鞘内注射10%盐酸利多卡因与2.5%盐酸布比卡因混合液时，当二者配比＞1∶1后，混合液的脊髓神经毒性显著增加，而二者配比≤1∶1时，二者混合液的神经毒性较轻。临床推荐剂量利多卡因与布比卡因的浓度分别为2%、0.5%，而本实验中所采用的药物浓度恰为临床推荐浓度的5倍，由此推测，临床上蛛网膜下隙阻滞麻醉时，混合应用2%盐酸利多卡因与0.5%盐酸布比卡因时，二者的容积比＜1∶1是相对安全的。TFL、PWT和后肢运动恢复时间是反映动物感觉功能和运动功能的常用指标，也是局部麻醉药神经毒性在动物行为学上的重要表现。本研究同时观察局麻药损伤最直接最严重的马尾神经及脊髓后角白质的病理改变，从而综合评价局麻药混合液的神经毒性。临床蛛网膜下隙麻醉时，布比卡因的药效要长于利多卡因，从本研究中观察大鼠后肢运动功能恢复时间发现，LB31组中虽然布比卡因浓度最低，但其运动恢复时间较LB21组出现了异常延长，其原因可能为药物的毒性损伤所致。本实验中，LB21组的病理损伤评分较对照组增加，但TFL等神经行为学的改变与对照组无显著差别，提示组织病理学的变化并不一定伴随着神经行为学的改变。分析原因可能为药物虽然对神经纤维造成一定病理损伤，但损伤范围较小，其周围邻近的未受损的神经纤维会代偿一部分功能，总的神经功能并未缺失，因而出现神经行为学与组织病理学改变不一致的现象。

综上所述，大鼠鞘内注射不同配比的10%盐酸利多卡因与2.5%盐酸布比卡因混合液时，脊髓神经毒性随着混合液中盐酸利多卡因的绝对浓度的增加逐渐加重，当二者容积比低于1∶1时脊髓神经毒性较轻。

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