线粒体损伤在创伤弧菌诱导树突状细胞凋亡中的作用*

徐水凌， 朱 佳， 张新红， 邵平扬， 郑文文

创伤弧菌(Vibrio vulnificus，Vv)属一种分布于海洋鱼类及贝母类、嗜盐性革兰阴性杆菌，主要经接触疫水或摄入被其污染的海产品，引起伤口感染、胃肠炎或原发性败血症，具有起病急、病情进展快、致死率高等特征［1-4］，是沿海地区一种致死率高的重要传染病［5］。创伤弧菌进入机体后，与宿主免疫细胞之间的相互作用，是了解和认识这种细菌致病机制的重要方面，也为临床寻找创伤弧菌感染的治疗靶点提供重要的理论基础，创伤弧菌的致病机制值得深入研究。树突状细胞(dentritic cell，DC)作为重要的抗原提呈细胞(antigen-presenting cell，APC)，在创伤弧菌感染的保护性免疫中起着始动者作用［6］。线粒体被认为是控制细胞凋亡或坏死的枢纽，可通过释放凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor，AIF)和细胞色素 C(cytochrome C，Cyt C)使细胞发生凋亡［7］。创伤弧菌感染树突状细胞后的线粒体损伤可能与细胞凋亡相关。因此，了解线粒体损伤在创伤弧菌诱导树突状细胞凋亡过程中的作用及其可能机制，NF-κB p65和TNF-α信号分子是否表达以及与细胞凋亡的关系，对深入阐明创伤弧菌的致病机制具有重要意义。

材料和方法

1 材料

创伤弧菌(Vv 1.1758株)购于中国科学院微生物研究所;小鼠树突状细胞(DC2.4)细胞株由浙江大学免疫研究所惠赠，本实验室常规培养并保存。RPMI-1640细胞培养液购自Gibco;胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自杭州四季青生物制品有限公司;四甲基偶氮唑盐(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)均购自Ameresco;Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)购自南京凯基生物科技发展有限公司;胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所;钙离子荧光探针Fluo-8/AM购自Abcam;NF-κB p65和 TNF-α鼠单克隆抗体均购自Cell Signaling Technology;羊抗鼠IgG-HRP购自Thermo;ECL免疫印迹底物购自Bio-Rad。

2 方法

2.1 Vv 1.1758 与 DC2.4 细胞混合培养模型建立Vv 1.1758经37℃、哥伦亚血琼脂培养基孵育24 h，挑取生长良好的菌落，无菌 PBS(pH 7.4，0.01 mol/L)洗3次后，重悬于不含抗生素的RPMI-1640培养液(含10%胎牛血清)，调整其细菌浓度为2.0×1010CFU/L，备用。取6孔细胞培养板，接种DC2.4细胞(5.2×108/L)各 2 mL，于 37 ℃、5%CO2培养箱孵育24 h。小心吸弃培养液，每孔加入2 mL 10%胎牛血清RPMI-1640培养液(无抗生素)，分别孵育2 h。小心吸弃培养液，按细菌∶细胞(MOI)约为40∶1的比例，每孔加入Vv 1.1758悬液1 mL(浓度为2.0×1010CFU/L)，Vv 1.1758与 DC2.4细胞在37 ℃分别共培育0、1、2、3、4、5 和6 h 时回收细胞。

2.2 扫描电镜观察Vv 1.1758侵入的DC2.4细胞收集0、2、4和6 h时段与 Vv 1.1758共育的 DC2.4细胞，弃培养液，加PBS吹打，2 500 r/min离心10 min，重复2次，以2%戊二醛磷酸缓冲液4℃固定2 h，PBS 洗3 次，每次30 min，1%锇酸固定1.5 h，PBS洗3次，每次30 min;梯度乙醇、丙酮逐级脱水;经置换、常规临界点干燥、粘台、喷金后，扫描电镜下观察Vv 1.1758侵入DC2.4细胞的形态学变化。

2.3 透射电镜观察DC2.4细胞线粒体的超微结构收集Vv 1.1758共培育的 DC2.4细胞，4%(V/V)戊二醛4℃固定2 h，PBS洗3次，锇酸再固定，丙酮脱水，树脂包埋，超薄切片后铅铀染色，透射电镜下观察DC2.4细胞线粒体的超微结构。

中国的茶叶在国际茶叶销售市场上的认可度普遍偏低，西方发达国家对我国出口的茶叶标准尤为严苛。江西出口茶叶缺乏自有知名品牌，这不仅影响出口贸易的收益，也不利于出口茶叶的国际竞争力的提高，更不利于对外贸易的持续发展。

2.5 细胞内Ca2+离子水平检测 采用Ca2+荧光探针Fluo-8/AM单染色法标记，收集上述共培育时段的5.2×108/L DC2.4细胞，以D-Hanks液洗涤3次，加入5 μmol/L Fluo-8/AM染液，37℃培养箱避光孵育30 min负载探针，Hanks洗涤3次。荧光显微镜及荧光成像系统扫描记录不同处理时点细胞内荧光强度，细胞荧光复合物的荧光强度经计算机软件(Zeiss)计算。

2.4 细胞内ROS水平的检测 采用DCFH-DA染色法检测 DC2.4 细胞内 ROS。收集 0、1、2、3、4、5 和6 h时段与 Vv 1.1758 共培育的 5.2 ×108/L DC2.4细胞爬片，每个载玻片中加入含10 μmol/L DCFHDA的无抗生素、无血清的RPMI 1640各600 μL，37℃避光孵育30 min，PBS洗涤载玻片3次，自然干燥，50%丙三醇/PBS封片，荧光显微镜及荧光成像系统扫描记录不同共育时点细胞内荧光强度(激发波长488 nm，发射波长527 nm)，荧光图像经计算机软件(Zeiss)计算细胞内荧光物的荧光强度。

2.6 细胞线粒体膜电位检测 收集0、2、4和6 h时段Vv 1.1758共培育的DC2.4细胞(各时段均设4个复孔)，加入JC-1染色工作液(5 mg/L)，37℃孵育20 min，以JC-1染色缓冲液洗涤2次，2 000 r/min、4℃离心5 min，收集细胞，PBS离心、洗涤2次后，以FL-1为绿色荧光检测通道，FL-2为红色荧光检测通道，流式细胞术检测绿色荧光率以反映线粒体膜电位的变化。

侵入前，DC2.4细胞线粒体饱满呈椭圆形粒状，线粒体嵴分布清晰 (图2A)。侵入时，Vv 1.1758与DC2.4细胞共育2 h，DC2.4细胞线粒体呈轻微球形肿胀，线粒体嵴出现断裂，基质变淡(图2B);4 h时，线粒体呈高度球形肿胀，线粒体嵴模糊不清(图2C);6 h时，线粒体膜破碎，嵴完全消失，大量空泡形成，细胞器结构紊乱(图2D)。

与 Vv 1.1758 和 DC 2.4 细胞共培育 0 h(65.6±7.8)比较，NF-κB p65 蛋白在共培育 1 h(98.8 ±10.2)、2 h(96.3 ± 9.1)、3 h(124.5 ± 13.5)、4 h(168.5 ±18.9)、5 h(198.5 ±19.6)和6 h(192.0 ±18.6)的表达量均上升(P ＜0.05);而 TNF-α 蛋白与共培育0 h(31.6 ±6.2)比较，2 h(58.3 ±8.2)、3 h(59.4 ±8.9)、4 h(63.4 ±8.7)、5 h(64.2 ±8.5)和6 h(92.6±9.6)的表达量上升(P ＜0.05)，见图 7。NF-κB p65蛋白表达在共培育1 h即开始升高，TNF-α蛋白则在共培育2 h开始增高。

侵入前，DC2.4细胞核呈圆形或椭圆形，细胞表面光滑，细胞间隔清晰(图1A);侵入时，Vv 1.1758与DC2.4细胞混合培养2 h，可见有少量Vv 1.1758菌体一端黏附于细胞表面(图1B);4 h时，DC2.4细胞呈现轻微肿胀，细胞有较多的Vv 1.1758黏附，Vv 1.1758以菌体一端与细胞表面结合方式侵入细胞(图1C);6 h时，DC2.4细胞呈现高度肿胀，细胞表面出现点状的球状突起，Vv 1.1758菌体整体黏附于细胞表面并侵入细胞(图1D)。

3 统计学处理

数据用均数±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0统计软件分析。各样本先进行方差齐性检验，再采用单因素方差分析法对资料进行处理，以P＜0.05为差异有统计学意义。

Vv 1.1758 与 DC2.4 细胞共育3、4、5 和6 h时，胞内 Ca2+荧光强度分别为 40.2 ±4.8、58.2 ±6.8、60.6±5.8 和 68.6 ±5.2，与对照组(18.4 ±2.2)比较，差异显著(P ＜0.05)，见图4。这提示 Vv 1.1758侵入DC2.4细胞后可导致胞内Ca2+升高。

结 果

1 扫描电镜观察DC2.4细胞的形态学变化

中南佛州水利工程的设计与施工完全由联邦政府主导，到20世纪70年代基本竣工。从本质上讲，该项目有很大的应急成分，因此，在应用、管理过程中一些过去没有考虑到的问题逐渐显现。

Figure 1.Vv 1.1758 invading the DC2.4 cells observed under scanning electronic microscope(×8 500，scale bar=1 μm).A:the control DC2.4 cells before invasion;B ～ D:the situations of Vv 1.1758 invading DC2.4 cells at 2，4 and 6 h，respectively.图1 Vv 1.1758侵入DC2.4细胞的扫描电镜照片

2 透射电镜观察DC2.4细胞线粒体的超微结构

2.7 细胞凋亡率检测 按上述方法收集Vv 1.1758共培育的 DC2.4 细胞，以 PBS(pH 7.4，0.01 mol/L)洗涤3次，然后分别用Annexin V-FITC和propidium iodide(PI)染色，按Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒操作说明书，流式细胞术检测各时段的细胞凋亡情况，计算细胞凋亡率。

Figure 2.Vv 1.1758 invading the DC2.4 cells observed under ttransmission electronic microscope(×16 000，scale bar=1 μm).A:the control DC2.4 cells before invasion;B ～ D:represented the situations of Vv 1.1758 invading DC2.4 cells at 2，4 and 6 h，respectively.图2 Vv 1.1758侵入DC2.4细胞的透射电镜照片

3 DC2.4细胞内的ROS水平

Vv 1.1758 与 DC2.4 细胞共培育2、3、4、5 和6 h时，DC2.4 细胞内的荧光强度分别为 28.9 ±5.6、31.2 ±7.8、37.2 ±6.9、49.6 ±8.9 和 38.6 ±7.2，显著高于对照组(9.8 ±1.2;P ＜0.05)，见图 3。这提示ROS在DC2.4细胞线粒体损伤和细胞凋亡中可能发挥重要的作用。

Figure 3.The changes of ROS fluorescence intensity in the DC2.4 cells co-cultured with Vv 1.1758 for different time(×200，scale bar=10 μm).Mean ± SD.n=4.*P ＜0.05，＊＊P ＜ 0.01 vs control.图3 DC2.4细胞与Vv 1.1758共培育不同时间细胞内ROS荧光强度的变化

4 DC2.4细胞胞内Ca2+的变化

飞速发展的信息技术已被广泛应用于课程教学中，与英语课程的融合日益加强。信息化教学对英语教师提出了更高的要求，教师不仅要及时更新和拓展自己的信息知识结构，更要具备灵活运用信息技术的能力。当前，各高校大部分英语教师的信息素养不高，信息技术知识比较匮乏，主要局限于简单的PPT课件制作，对较复杂的教学编辑软件操作不熟悉。英语教师信息技术应用能力不高，一方面缘于教师自身没有及时更新知识所致，另一方面各高校组织英语教师进行有关信息技术应用的培训较少，这成为制约当前高校英语数字化教学资源共建共享的瓶颈。

5 DC2.4细胞线粒体膜电位的变化

Vv 1.1758与 DC2.4细胞共培育2、4和6 h后，流式细胞术检测细胞绿色荧光率分别为(18.9±3.5)%，(49.9 ±8.7)%和(62.5 ±11.5)%，显著高于对照组［(6.9 ±0.6)%;P ＜0.05］，线粒体膜电位分别下降 12.0%、43.0%和 46.6%，见图 5。

6 Vv 1.1758 诱导 DC2.4 细胞凋亡

Vv 1.1758 与 DC2.4 细胞混合培养2、4 和6 h，细胞凋亡率分别为(27.8 ±8.6)%、(36.3 ±11.7)%和(56.8±15.6)%，显著高于正常 DC2.4细胞对照组［(3.2 ±0.8)%;P ＜0.05］，并呈一定的时间依赖性，见图6。

Figure 4.Intracellular Ca2+fluorescence intensity in the DC2.4 cells co-cultured with Vv 1.1758 for different time.Mean ± SD.n=4.*P ＜0.05，＊＊P ＜ 0.01 vs control.图4 DC2.4细胞与Vv 1.1758共培育不同时间细胞内Ca2+的变化

Figure 5.The changes of mitochondrial transmembrane potential of the DC2.4 cells co-cultured with Vv 1.1758 for different time.A:the control DC2.4 cells before invasion;B ～ D:the situations of Vv 1.1758 invading DC2.4 cells at 2 h，4 h and 6 h，respectively.图5 DC2.4细胞与Vv 1.1758共培育不同时间线粒体膜电位的变化

Figure 6.Apoptotic rates of the DC2.4 cells induced by Vv 1.1758.A:the normal DC2.4 cells;B ～ D:the apoptotic rates of DC2.4 cells co-culture with Vv 1.1758 for 2 h，4 h，6 h，respectively.图6 Vv 1.1758诱导DC2.4细胞凋亡率变化

7 NF-κB p65 和 TNF-α蛋白的表达

2.8 Western blotting检测 收集 0、1、2、3、4、5 和 6 h共育时段的 DC2.4细胞，加入250 μL含 PMSF的RIPA细胞裂解液，超声破碎细胞(300 V，1 s×5)，15 000 r/min(离心半径7.5cm)离心10 min，BCA 法测定上清液蛋白浓度，加等体积的2×电泳加样缓冲液，95℃水浴5 min，上样，电泳(浓缩胶20 mA，分离胶35 mA)，电转膜仪转移至PVDF膜上(120 mA，120 min)，10%脱脂奶粉室温封闭4 h，TBST漂洗3次，分别加入1∶200稀释的 NF-κB p65和 TNF-α 鼠单克隆抗体，4℃孵育过夜，1∶2 000稀释的羊抗鼠IgG-HRPⅡ抗孵育2 h，TBST洗膜3次后ECL显色，ChemiDocTMMP系统记录不同时段 NF-κB p65和TNF-α的表达。以Quality One软件计算蛋白产物条带的相对吸光度值。

Figure 7.Western blotting analysis of NF-κB p65 and TNF-α expression in the DC2.4 cells co-cultured with Vv 1.1758 for different time.图7 DC2.4细胞与Vv 1.1758共培育不同时间NF-κB p65和TNF-α蛋白表达的变化

讨 论

DCs是人体内重要的免疫细胞，其作为体内重要的抗原递呈细胞，在抗病原菌早期感染及其抗原的加工和提呈中起着重要的作用［8-9］。在创伤弧菌与免疫细胞间相互作用的研究中发现，创伤弧菌可将淋巴细胞作为靶细胞诱导淋巴细胞发生凋亡［10］，巨噬细胞也可发生类似的细胞凋亡作用［11］。创伤弧菌能否诱导DC凋亡，从而实现免疫逃逸，达到在体内生存并繁殖的目的，对深入了解创伤弧菌感染的致病机制，为临床治疗选择合理的治疗靶位具有重要意义。

3.施工企业综合竞争力不断增强。通过清理项目管理程序、规范管理制度、优化项目管理组织，促进了先进的管理方式、先进管理理念的运用。强化了项目前期风险防控，优化施工组织，引进了先进工艺，企业产能工程达产率逐步提升，经济效益得到提高，施工队伍素质和管理水平得到提高，企业的客户满意率不断上升，外部市场开拓空间不断加大，企业核心竞争力稳步增强。

线粒体不仅是细胞的能量工厂，而且也是细胞凋亡的调控中心，主要经Cyt C-caspase-9依赖途径和非caspase依赖途径调控细胞凋亡，众多致病因素如:病原菌感染、炎症反应、缺血-再灌注等均可通过线粒体的损伤而诱导细胞凋亡［12-13］。我们先前已发现，Vv感染DC可通过TLR2、4受体表达上调，TNF-α炎症介质增加导致DNA降解，诱导DC细胞凋亡和坏死［14］。本实验经扫描和透射电镜观察发现，Vv 1.1758与DC2.4细胞混合培养2 h，即可有少量Vv 1.1758菌体一端黏附于细胞表面，线粒体呈轻微球形肿胀，线粒体嵴出现断裂，基质变淡;共育4 h时，DC2.4细胞表面则有较多的Vv 1.1758黏附，以菌体一端与细胞表面结合方式侵入细胞，细胞线粒体呈高度球形肿胀，线粒体嵴模糊不清;6 h时，菌体整体黏附于细胞表面并侵入细胞，DC2.4细胞呈现高度肿胀并出现点状的球状突起，线粒体膜破碎，嵴完全消失，胞内有大量空泡形成。提示:Vv 1.1758侵入DC2.4细胞的早期，即可引起DC线粒体损伤。此外，线粒体呼吸链是细胞内ROS产生的主要场所，胞内ROS的升高可引起线粒体的损伤，DCFH-DA是目前最为常用和灵敏的胞内ROS检测的荧光探针，DCF的荧光强度可反映胞内ROS水平［15］。本实验结果显示，Vv 1.1758与 DC2.4细胞共育2 h时，ROS即开始升高，至5 h达高峰。我们推测:Vv 1.1758引起的DC2.4细胞线粒体损伤，与胞内ROS的升高密切相关。

田林平塘高山汉族谚语研究——百色市高山汉族语言文化系列研究之一 ………………………………………… 黄 革（6/64）

电网调度系统容易受到一些不可抗因素的影响，例如自然灾害等。一旦遇到大的自然灾害，电网将会有可能中断。这时，必须建立起应急响应机制，使得电网调度能够在自然灾害发生后电网出现故障的情况下，应急机制能够及时发挥作用。当前的许多地方，由于对自然灾害等不可抗因素的认识不够充分，重视程度不够，或者没有建立应急响应机制或者是应付差事的应急响应机制，这就严重影响了电网的安全运行。

线粒体除合成机体所需的ATP外，也具有摄取、释放、调节胞内Ca2+浓度的作用。大量研究证实，细胞内钙失衡是启动细胞凋亡的关键因素［16］。胞内Ca2+增多，可引起线粒体膜电位降低，从而使线粒体内贮钙进一步释放，引起细胞内钙持续增加以及DNA断裂，由此形成恶性循环，最终导致细胞凋亡或死亡;此外，ROS也可加剧 Ca2+的超载［17］。本研究中我们发现，Vv 1.1758与DC2.4细胞共育3 h时，细胞内Ca2+迅速升高，并随共育时间的延长，细胞内Ca2+升高更趋明显，呈一定的时间依赖性;共育2 h、4 h和6 h时，线粒体膜电位值分别下降12.0%、43.0%和46.6%;细胞凋亡率则分别为(27.8±8.6)%，(36.3 ±11.7)%和(56.8 ±15.6)%，明显高于正常DC2.4细胞对照组(3.2±0.8)%(P＜0.05)。我们认为创伤弧菌在侵入DC2.4细胞时，同样存在着细胞内钙的失衡，胞内Ca2+浓度的显著升高和线粒体膜电位下降，是诱导DC2.4细胞发生凋亡的另一重要环节。

NF-κB是众多细胞因子和炎症介质表达的转录因子之一，主要由两种Rel家庭蛋白构成的同源或异源二聚体蛋白质，p65是Rel家庭成员之一，其表达与免疫和炎症反应高度相关，NF-κB p65的活化可诱导产生大量TNF-α、IL等促炎因子，参与细胞凋亡等多种生物过程［18-19］。本研究发现，NF-κB p65 蛋白在Vv 1.1758与DC2.4细胞共育1 h，即开始升高，至5 h达高峰，共育6 h稍有下降;TNF-α蛋白则在共育2 h开始增高，至6 h达高峰。这提示:NF-κB p65和TNF-α有可能是创伤弧菌诱导树突状细胞凋亡过程中的重要信号分子。

我们的实验结果表明，线粒体损伤在Vv 1.1758诱导DC2.4细胞凋亡中起着重作用，其机制可能与胞内ROS的升高、Ca2+浓度的显著升高和线粒体膜电位下降有关，NF-κB p65和TNF-α有可能是细胞凋亡过程中的重要信号分子。然而，在线粒体损伤时，非caspase依赖的AIF、核酸内切酶G等是否释放表达，尚有待进一步研究证实。

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