真武汤对链脲佐菌素所致大鼠糖尿病肾病的保护作用*

徐中菊， 张 悦， 舒 适， 张瑞义

糖尿病肾病是糖尿病临床常见的并发症，也是糖尿病患者的主要致死致残原因之一［1］。临床采用中药防治糖尿病肾病效果显著，许多研究也证实中药防治糖尿病肾病具有多靶点、多途径、多环节的作用特点，能有效控制和延缓肾功能恶化［2］。本研究通过观察真武汤(Zhenwu decoction，ZWD)对链脲佐菌素(streptozocin，STZ)所致糖尿病肾病大鼠的肾功能、24 h尿蛋白定量及肾组织病理改变等影响，明确真武汤防治糖尿病肾病的作用效果，为真武汤在糖尿病肾病的临床应用提供理论依据。

材料和方法

1 材料

1.1 动物 健康 SPF级雄性 SD大鼠［220±20］g61只，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物许可证号为［SCXK(沪)2008-0016］。

1.2 药物 真武汤制备:按茯苓9 g，芍药9 g，白术6 g，生姜9 g，附子9 g的比例，由上海中医药大学中药所制成生药量1.2 kg/L浓缩液备用。

1.3 主要试剂 RIPA裂解液(北京普利莱基因技术有限公司，C1053);苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF;Amresco);丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase，SOD)和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)试剂盒(南京建成生物有限公司);磷酸酶抑制剂混合物Ⅱ(生工生物工程有限公司);BCA蛋白定量试剂盒(Pierce);兔单抗NF-κB(Cell Signaling);小鼠单抗 α-平滑肌肌动蛋白(αsmooth muscle actin，α-SMA;Sigma);小鼠单抗 GAPDH(上海康成生物工程公司);蛋白Marker(Fermentas);Tween-20和ECL化学发光试剂盒(碧云天)。1.4 主要仪器 雅培血糖仪(Optium Xceed)及快速血糖试纸(雅培公司)，倒置荧光显微镜(Olympus)，全自动荧光成像系统(HR16)，全自动生化分析仪(Hitachi)，全波长酶标仪(BioTek Power Wave XS2)，紫外透射分析仪 (复日科技FR-200紫外与可见分析装置)。

2 方法

2.1 糖尿病肾病模型的制备与分组给药 全部大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常组(normal)16只和造模组(STZ)45只，造模组禁食12 h，按60 mg/kg一次性腹腔注射STZ。标准饮食喂养，自由饮水。1周后，尾静脉取血测量大鼠空腹血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病模型大鼠。模型大鼠根据血糖随机分为模型组(STZ，22只)和真武汤治疗组(STZ+ZWD，23只)，分别给予真武汤生药 3 g·kg－1·d－1，模型组和正常组给予等量蒸馏水灌胃。

2.2 标本收集 治疗第8周末收集24 h尿液并记录24 h尿量，作24 h尿蛋白定量检测;取材，处死大鼠前称重，以3%戊巴比妥钠(购自上海中医药大学动物实验中心)按2 mL/kg体重的剂量腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，测血糖(glucose，GLU)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血肌酐(serum creatinine，SCr)等生化指标，取双侧肾脏，用滤纸吸干肾表面血液后称重，取部分肾组织固定于4%甲醛中用于石蜡切片制备。

3 指标测定

3.1 肾系数的测定 肾系数(%)=两侧肾重和(g)/体重(kg)×100%。

3.2 24 h 尿蛋白总量(total protein，TP)、SCr、BUN和GLU测定 全自动生化仪测定。

3.3 大鼠肾组织氧化应激指标SOD活性、MDA及iNOS含量测定 称取约100 mg－80℃保存的肾组织，放入1.5 mL的Ep管中，加入生理盐水1 mL，于超声破碎仪中(冰浴)匀浆3次，4℃、2 500 r/min离心15 min;吸取上清置于另一1.5 mL的Eppendorf管，按照BCA蛋白定量试剂盒操作步骤进行蛋白定量，以测算其蛋白浓度，另按照试剂盒说明书测定SOD、MDA和iNOS吸光度，根据公式计算 SOD活性、MDA及iNOS含量。

3.4 肾脏病理检查 取肾皮质，4%中性甲醛固定，乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、制成3 μm石蜡切片，HE染色后光镜观察。

3.5 肾组织 α-SMA和 NF-κB蛋白表达测定 取－80℃保存的肾组织约100 mg，置入1.5 mL的Eppendorf管中，加入预冷的裂解缓冲液1 mL，于超声破碎仪中(冰浴)匀浆3次后置于冰上20 min;4℃、12 000 r/min离心15 min;吸取上清置于另一1.5 mL的Eppendorf管中，－80℃保存2 d，解冻后12 000 r/min离心15 min，取上清即为所提取的蛋白溶液。取少量上清液按照BCA蛋白定量试剂盒操作步骤进行定量。将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合加2×载样缓冲液后于100℃煮沸变性5 min，保存于－20℃冰箱。

将变性好的组织样品冰浴5 min后上样，每孔加10 μg蛋白样品，积层胶电压80 V，分离胶电压120 V电泳。电泳结束后，转膜1h(经甲醇处理的PVDF膜)，将转有蛋白的PVDF膜置于5%BSA封闭1 h后，置于I抗(α-SMA及 NF-κB抗体分别用封闭液1∶2 000稀释，GAPDH 抗体按1∶5 000稀释)中，置4℃摇床振荡过夜，1×TBS洗4次，每次8 min。置HRP标记的Ⅱ抗(用封闭液1∶5 000稀释)中孵育2 h，1×TBS洗4次，每次8 min，在暗室取ECL A和B试剂1∶1混合后覆盖膜上，1.5 min后弃去化学发光试剂，将膜放入暗盒内，用X光胶片进行曝光、显影及定影。复日科技FR-200紫外与可见分析装置图像分析系统扫描Western blotting条带的灰度，计算目的蛋白与内参照的比值(相对灰度值)。

4 统计学处理

数据用均数±标准差(mean±SD)表示，应用SPSS 16.0软件分析，计量资料采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 一般情况

大鼠自造模之日起出现多饮、多食、多尿，体重减轻，精神萎靡，活动倦怠，毛发杂乱泛黄偶有脱毛。

2 各组大鼠体重和肾系数的变化

与正常大鼠比较，模型大鼠肾系数明显升高(P ＜0.01)，体重明显下降(P ＜0.01);真武组大鼠的肾系数显著低于模型组 (P＜0.05)，体重则无显著差异，见表1。

表1 各组大鼠体重和肾系数比较Table 1.Comparison of the body weight and renal coefficient of the rats in different groups(Mean±SD)

3 各组大鼠生化指标的比较

造模大鼠的24 h尿蛋白定量、血尿素氮、血清肌酐和血糖均显著高于正常组(P＜0.05)，说明大鼠糖尿病肾病模型建立成功;真武组24 h尿蛋白、尿素氮、肌酐和血糖明显低于模型组(P＜0.05)，见表2。

表2 各组大鼠生化指标比较Table 2.Comparison of TP and biochemical indicators in different groups(Mean ±SD)

4 各组大鼠肾组织SOD、MDA及iNOS水平比较

与正常组比较，模型组 SOD活显著性降低、MDA含量显著升高(P＜0.05)，真武组MDA含量低于模型组，出现显著差异(P＜0.05)，iNOS活性高于模型组(P ＜0.05)，见表3。

表3 各组大鼠肾组织SOD、MDA和iNOS测定结果的比较Table 3.Comparison of SOD，MDA and iNOS in different groups(Mean±SD)

5 各组大鼠肾组织病理变化

HE染色可见正常大鼠肾组织形态正常，小球形态规则，小管排列紧密整齐，肾小管上皮细胞形态正常。模型大鼠肾小球肥大、毛细血管基底膜增厚，系膜基质增生，肾小管上皮细胞空泡样变，可见蛋白管型，肾间质纤维组织增生明显;真武组肾小球形态基本正常，仅有少量肾小管上皮细胞空泡样变，偶有蛋白管型，病变明显轻于模型组，见图1。

6 真武汤对糖尿病肾病大鼠α-SMA及NF-κB蛋白表达的影响

模型大鼠肾组织α-SMA蛋白的水平明显高于正常组(P＜0.05)，STZ+ZWD组大鼠的肾组织α-SMA蛋白水平明显低于STZ组(P＜0.05)，见图2。

模型大鼠肾组织NF-κB蛋白的水平明显高于正常组(P＜0.05)，STZ+ZWT组大鼠的肾组织NF-κB 蛋白水平明显低于STZ组(P＜0.05)，见图3。

Figure 1.The pathological changes of renal tissues in rats(HE staining，×400).A:normal;B:STZ;C:STZ+ZWD.图1 各组大鼠组织病理变化

Figure 2.Protein expression of α-SMA detected by Western blotting.Mean± SD.n=3.*P ＜0.05 vs nomal;#P ＜0.05 vs STZ group.图2 各组大鼠α-SMA蛋白的表达

讨 论

中医无糖尿病肾病病名，《素问，病机气宜保命集》有“肾消者，病在下焦，初发为膏淋，下如膏油之状，至成而面色黧黑，形瘦而耳焦，小便浊而有脂”的记载，将该病称为“肾消”为宜;《灵枢·五变》说:“五脏皆柔弱者，善病消瘅”，指出五脏虚弱是发生本病的重要因素。历代医家将按其临床症状将之归于中医“消渴”、“水肿”、“尿浊”、“肾劳”“关格”等证。《圣济总录》云:消渴病久肾气受伤，肾主水，肾气虚衰，小便至甜，有膏，揭示了糖尿病肾病尿液的变化。

现代医学研究表明，糖尿病肾病是由于糖代谢紊乱及其所导致的血流动力学、细胞因子、生长因子等多种因素综合作用的结果。其中氧化应激反应增强、活性氧族(reactive oxygen species，ROS)产生增多，在糖尿病肾病的发生发展中可能发挥了重要的作用［3］。近年来体内外实验研究表明，高血糖可以影响大鼠肾脏组织中抗氧化酶的表达，升高糖尿病大鼠肾脏组织的氧化应激水平，在糖尿病肾病发病机制中起重要作用［4］，同时还可以激活NF-κB的活性。NF-κB作为一种核转录调节因子，能与多种细胞基因的启动子和增强子中的κB序列位点特异结合，参与免疫反应、淋巴细胞分化、生长控制、细胞内信号传递、调节体内众多细胞因子和炎症介质基因的表达。高糖通过 ROS激活 NF-κB，NF-κB再促进系膜细胞单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)基因转录，上调 MCP-1的表达，导致肾组织炎症的发生、发展;也有报道，肿瘤坏死因子可激活SD大鼠肾小球系膜细胞NF-κB，并诱导血管紧张素原表达及血管紧张素Ⅱ产生和增加［5］，而抑制NF-κB活性不但可以可降低肾组织血管紧张素Ⅱ含量，还延缓实验性糖尿病大鼠肾病的发生［6］。同时，高血糖诱导的ROS还能增加细胞外基质的合成，促使肾小球肥大，从而诱导纤连蛋白、胶原和转化生长因子β1等表达增加［7-9］，促进系膜细胞表达α-SMA而发生表型转化［10］，使系膜细胞能够产生更多I、Ⅲ、Ⅳ型胶原，纤连蛋白及层黏连蛋白，从而进一步加剧肾脏的纤维化。

真武汤出自《伤寒论》，是治疗脾肾阳虚、水湿泛滥的代表方剂。方中炮附子温肾复阳，白术健脾制水，茯苓淡渗利水，生姜宣散水气，四味相配共奏温阳利水之功，在各种原因引起的阳虚肾病中运用广泛。实验研究也证实该方能显著增强自由基清除能力，减少受自由基攻击的脂质过氧化产物［11］;减少阿霉素肾病大鼠肾组织羟脯氨酸含量，改善肾功能及减轻病理损伤［12］;明显改善醋酸氢化可的松肾阳虚大鼠的肾功能，改善肾小球滤过膜的通透性，促使代谢产物肌酐、尿素氮的排出，减少血浆白蛋白的大量丢失［13］。

为进一步探讨真武汤防治糖尿病肾病机制，我们采用60 mg/kg剂量的STZ［14］大鼠腹腔注射的方法复制了糖尿病肾病大鼠模型。造模后模型动物出现血糖增高和蛋白尿，肾组织病理切片出现肾小球肥大，毛细血管基底膜增厚，系膜基质增生，肾小管上皮细胞空泡样变，蛋白管型，肾间质纤维组织增生等，表明模型制备成功。经真武汤水煎剂灌胃治疗8周后，治疗组大鼠的一般情况及肾功能均有所改善，肾纤维化程度也较模型组显著减轻，提示真武汤能有效防治糖尿病肾病的肾纤维化。与正常组比较，模型大鼠SOD显著降低，MDA显著升高，提示脂质过氧化损伤了糖尿病大鼠肾组织并加重糖尿病肾病进程。真武汤组MDA显著低于模型组(P＜0.05)，iNOS显著高于模型组(P＜0.05)，模型大鼠肾组织α-SMA及NF-κB蛋白的水平明显高于正常组(P＜0.05)，STZ+ZWD组大鼠的肾组织α-SMA蛋白水平明显低于STZ组(P＜0.05)，表明真武汤可通过降低血糖，抑制肌成纤维细胞的形成，减少细胞外基质的产生，抑制NF-κB蛋白的表达来提高肾脏抗氧化损伤的作用，减轻糖尿病肾病时肾脏局部氧化应激反应等环节发挥肾脏保护作用，减少蛋白尿并改善糖尿病肾病大鼠肾功能从而延缓糖尿病肾病的病程。

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