硫化氢抑制大鼠急性心肌缺血引起的细胞炎症反应*

谢英花， 马燕山， 张 楠， 张建新△

我国每年心血管疾病占总死亡原因的41%［1］。其中缺血性心脏病可引发自由基损伤、钙超载、炎症瀑布反应等，进而诱发心绞痛，甚至心肌梗死［2］。此类心脏病防治的重点是如何解除或减轻缺血性损伤。随着研究的深入，发现炎症损伤在缺血性心肌病的发生、发展中起关键作用［3-4］。研究表明H2S在心肌缺血/再灌注模型中发挥抗炎作用［5-6］。但其对离体急性心肌缺血损伤的影响与炎症反应之间的关系，目前尚不明确。本研究采用离体大鼠急性缺血损伤模型，观察H2S对急性缺血时心肌细胞产生的炎症细胞因子的影响，探讨H2S的心肌保护作用机制。

材料和方法

1 材料

1.1 仪器、药品与试剂 NaHS购自Sigma;Prime-Script RT Reagent(Prefect Real Time)、SYBR Premix Ex TaqTM(Prefect Real Time)、RNAiso Plus Reagent、EASY Dilution(for Real Time PCR)和DL2000 DNA Marker均购自TaKaRa;BCA法蛋白定量试剂盒、预染蛋白marker均购自上海捷瑞生物工程有限公司;鼠NF-κB p65和β-actin多克隆抗体购自Santa Cruz。八道生理记录仪PowerLab/8S(AD Instrument);PCR Thermal Cycler Dice和PCR Thermal Cycler Dice Real Time System(TaKaRa);凝胶成像系统(UVP)。

1.2 动物及分组 SPF级♂SD大鼠40只，体重(270±20)g，由河北省实验动物中心提供，随机分为5组，每组8只，分别为:假手术组(sham)、缺血组(ischemia)以 及 NaHS 5 μmol/L、10 μmol/L 和20 μmol/L剂量组。假手术组冠状动脉左前降支只穿线但不结扎。缺血组建立缺血模型。NaHS各剂量组亦制备缺血模型，缺血2 h时更换为5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L NaHS灌流液。假手术组和缺血组用正常灌流液灌流。

2 方法

2.1 离体大鼠急性心肌缺血损伤模型的制备 大鼠腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉后，迅速开胸，取出心脏，置于盛有混合气饱和预冷K-H液的平皿中，清洗残留血液，经主动脉逆行插管，悬挂于Langendorff灌注装置，使用95%O2+5%CO2混合气饱和的K-H液恒压灌注，循环恒温水浴维持灌注系统温度在(37±0.5)℃。离体心脏经Langendorff模型平衡灌注20 min后，结扎冠状动脉左前降支，造成心肌急性缺血。结扎成功后每分钟冠脉流量下降30%左右，心肌收缩力下降至原来1/3～1/2，心脏缺血区表面发白。继续灌流4 h。

2.2 心功能测定 记录各组缺血末 ±dp/dtmax、左室舒张压(left ventricular diastolic pressure，LVDP)和冠脉流量(coronary flow，CF)等心功能指标。

2.3 实时荧光定量PCR测定心肌组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和ICAM-1 mRNA的表达 各组实验结束后摘取心脏，用冰生理盐水冲洗干净，无菌环境下取部分左心室前壁组织，迅速放入超低温冰箱中，留待进行实时荧光定量PCR测定。

将冷冻组织100 mg在预冷好的研钵中研磨至粉状。用RNAiso Plus 2 mL完全覆盖样品。室温静置。使之完全融化，后研磨直至得到透明裂解液。转移匀浆液，室温下静置5 min。4℃、13 000 r/min离心5 min后，将上清转移至新的1.5 mL离心管。按0.2 mL/1 mL的比例加入CHCl3，并振摇使之混匀。接着室温静置5 min，4℃、1 350 r/min离心15 min后，取 500μL上清，加入等体积的(CH3)2CHOH，混匀。室温静置10 min，4℃、13 000 r/min离心10 min。弃去上清液。用-20℃预冷的75%的乙醇1 mL清洗沉淀。后4℃、13 500 r/min离心5 min处理。弃去上清液，室温放置干燥。沉淀用RNase Free dH2O 40 μL溶解，在-80℃冰箱中保存，备用。

配制RT反应液(配制在冰上进行)进行逆转录反应，可有效地将全长mRNA反转录成cDNA。配制real-time PCR反应液(配制在冰上进行)。GAPDH引物序列正义链 5′-ATGATTCTACCCACGGCAAG-3′，反义链 5′-CTGGAAGATGGTGATGGGTT-3′;IL-6 引物序列 正 义 链 5′-TAGTCCTTCCTACCCCAACTTCC-3′，反义链 5′-TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3′;IL-1β 引物序列正义链 5′-GACCTGTTCTTTGAGGCTGACA-3′，反义链 5′-CTCATTGGACAGCCCAAGTC-3′;TNF-α 引物序列正义链 5′-CCCAGACCCTCACACTCAGAT-3′，反义链 5′-TTGTCCCTTGAAGAGAACCTG-3′;ICAM-1引物序列正义链5′-CCCCACCTACATACATTCCTAC-3′，反 义 链 5′-ACATTTTCTCCCAGGCATTC-3′;IL-10引物序列正义链 5′-CAGACCCACATGCTCCGAGA-3′，反义链 5′-CAAGGCTTGGCAACCCAAGTA-3′。引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。反应条件:95℃ 10 s;95℃ 5 s，60℃ 20 s，40个循环。

Real-time PCR定量分析数据由计算机收集，绘制动力学曲线，测定每个样品的Ct值，用2-ΔΔCt方法分析各组 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 和 ICAM-1 mRNA表达的差异。

2.4 Western blotting半定量测定心肌组织NF-κB的表达 实验结束后摘取心脏，剪取左心室前壁部分组织，迅速放入超低温冰箱中保存，留待进行Western blotting检测。将裂解的心肌组织离心得沉淀，加核蛋白提取液，研磨，离心，上清液与点样缓冲液热变性，做聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，用TBST洗涤，5%脱脂奶粉封闭，加稀释的NF-κB p65Ⅰ抗，再加相应的Ⅱ抗，ECL显色，扫描条带，转换为数字图像，ImageJ图像分析软件半定量分析蛋白条带。

3 统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示，通过SPSS 13.0统计软件进行多组间单因素方差分析(One-way ANOVA)，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 离体心肌组织心功能的变化

各组缺血末±dp/dtmax、LVDP、CF等心功能指标见表1。结果表明，ischemia组心脏的 LVDP、±dp/dtmax和 CF均呈明显下降(与 sham组相比，P＜0.01)。NaHS 5 μmol/L、10 μmol/L 和 20 μmol/L 组心脏的上述指标均明显高于ischemia组(P＜0.05或P＜0.01)，说明H2S改善了离体急性缺血心肌功能。

表1 H2S对心功能的影响Table 1.The effect of H2S on the cardiac functions in the rat hearts after ischemia(Mean±SD.n=8)

2 H2S 对离体心肌组织中 TNF-α、ICAM-1、IL-1β、IL-10和IL-6 mRNA表达的影响

Ischemia 组离体心肌组织中 IL-1β、TNF-α、ICAM-1和IL-6 mRNA表达明显增强，IL-10 mRNA的表达明显降低(与sham组相比，P＜0.01);与ischemia组相比，各 NaHS剂量组离体心肌组织中 IL-1β、TNF-α、ICAM-1和IL-6 mRNA表达显著降低，10 μmol/L和20 μmol/L NaHS组离体心肌组织中IL-10 mRNA表达显著升高(P＜0.05或P＜0.01)，见图1、2。

3 H2S对离体心肌组织中NF-κB表达的影响

Sham组离体心肌组织中仅有很少量NF-κB的表达;ischemia组离体心肌组织中NF-κB的表达明显升高(与sham组相比，P＜0.01);与ischemia组相比，10 μmol/L 和 20 μmol/L NaHS 组离体心肌组织中NF-κB的表达显著下降(P＜0.05或P＜0.01)，见图3。

Figure 1.Effects of H2S on the mRNA expression of TNF-α，IL-6 and IL-1β in rat myocardial tissues.＊＊P ＜0.01 vs sham;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs ischemia.图1 H2S对离体心肌组织中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达的影响

Figure 2.Effects of H2S on the mRNA expression of ICAM-1 and IL-10 in rat myocardial tissues. ＊＊P ＜0.01 vs sham;#P＜0.05，##P＜0.01 vs ischemia.图2 H2S对离体心肌组织中ICAM-1和IL-10 mRNA表达的影响

Figure 3.The effect of H2S on the protein level of NF-κB in rat myocardial tissues detected by Western blotting.＊＊P ＜0.01 vs sham;#P＜0.05，##P＜0.01 vs ischemia.图3 H2S对离体心肌组织中NF-κB表达的影响

讨 论

本研究采用Langendorff离体灌流心脏和结扎左冠状动脉前降支，成功复制大鼠急性心肌缺血损伤模型。实验发现急性缺血后，心肌收缩力减弱，心功能降低。NF-κB出现明显移位，核NF-κB表达量明显增加，并伴随心肌组织中 IL-1β、TNF-α、ICAM-1和IL-6 mRNA表达增强，IL-10 mRNA表达明显降低。而H2S能明显对抗心肌缺血所致的LVDP降低，增加LVDP、±dp/dtmax及冠脉流量，抑制炎症细胞因子释放，保护急性缺血心肌。

心肌急性缺血初期仅有部分心肌细胞坏死，但随着大量炎症细胞浸润到心肌组织梗死区，心肌细胞坏死和凋亡的范围逐步扩大，形成较大面积心肌梗死，加速心功能恶化。炎症反应是导致心肌梗死后心脏病理学损伤的重要原因［7-8］。因此调控心肌梗死后炎症反应，恢复细胞因子网络平衡，是减轻心肌梗死后心脏损伤的关键［9-10］。

NF-κB是一种活跃的核转录因子，参与调控多种炎症递质及细胞因子基因的表达，在细胞因子网络失衡中起关键作用。研究表明心肌梗死后缺氧、氧化应激等活化信号能够激活NF-κB，并转位进入细胞核，进而诱导黏附分子家族的ICAM-1，前炎症因子 TNF-α、IL-1β、IL-6 等的表达上调［9］，导致心肌炎症反应，引起心肌缺血损伤。而若能抑制NF-κB的活化和表达，可抑制炎症反应，促进心脏修复［11］。IL-lβ是IL-1的亚型之一，发生心肌缺血时，对心肌细胞具有直接的毒性作用，并能促进内皮细胞与中性粒细胞黏附［12］。IL-6是炎症反应中的核心调节因子，可广泛作用于多个系统。ICAM-1表达升高会增加中性粒细胞浸润、黏附，并可进一步恶化，加重心肌组织细胞损伤［13］。TNF-α是重要的初级炎症因子，在应激状态下，可在心肌大量表达［12］。而IL-10为多功能、多细胞源性的炎症抑制因子。若其产生受到抑制，促炎细胞因子将失去负反馈抑制作用，使炎症不断进展和恶化［14］。NF-κB的激活在炎症细胞因子表达中起着关键作用，而且两者相互促进，所以调节NF-κB的活性将有利于改善炎症反应，抑制心室的重构［15］。

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