c-Myc抑制剂10058-F4对伊马替尼耐药细胞的增殖抑制作用*

龙梓洁， 方志刚， 潘晓娜， 范蕊芳， 林东军

慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia， CML)是一种血液系统恶性肿瘤，其产生的大量白细胞在骨髓内聚集，抑制骨髓的正常造血。目前，酪氨酸激酶小分子抑制剂伊马替尼(imatinib)已经成为治疗CML的一线用药，使得CML患者的5年生存率明显提高，但是仍有部分患者对伊马替尼缺乏敏感性，产生耐药或复发［1］。因此，寻找新的有效治疗方法克服CML对伊马替尼的耐药性成为当前迫切需要解决的问题。

myc基因编码的蛋白在肿瘤发生发展中起重要作用。人类 c-myc基因定位于 8q24，c-Myc蛋白与Max蛋白形成异二聚体，异二聚体与靶基因的E-box DNA(5’-CACGTG-3’)区域结合，发挥转录功能，调节下游基因［2］。c-Myc蛋白参与细胞的生长、增殖、凋亡、分化、肿瘤形成及肿瘤耐药等各个过程，并参与了多种信号通路的调控，包括 Wnt/β-catenin、phosphatidylinositol 3-kinase/Akt(PI3K/Akt)和Ras GTPase/MAP kinase(Ras/MAPK)等。在乳腺癌、前列腺癌、胃肠道肿瘤和黑色素瘤等多种实体瘤以及血液肿瘤中均发现c-Myc的异常表达，且与肿瘤的分期和预后相关［3］。研究报道c-Myc在白血病的发病及疾病进程中起关键作用［4］。鉴于c-Myc作为肿瘤治疗靶点的潜在性，各研究机构纷纷致力于c-Myc小分子抑制剂的研发。其中，10058-F4在多种肿瘤如肝癌以及白血病研究中均显现出良好的抗肿瘤效果［5-6］。本文旨在探讨c-Myc小分子抑制剂10058-F4对K562及伊马替尼耐药的K562/G细胞的抑制作用，从而为临床上治疗CML提供新的治疗策略。

材料和方法

1 主要试剂

胎牛血清及RPMI-1640培养基购自Gibco，c-Myc小分子抑制剂10058-F4、c-Myc抗体及GAPDH抗体为Santa Cruz产品，甲磺酸伊马替尼为Selleckchem产品，甲基纤维素为R＆D产品，其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

2 主要方法

2.1 细胞培养 K562细胞(购自American Type Culture Collection)及伊马替尼耐药的K562/G细胞(由K562细胞通过逐渐增加伊马替尼浓度培养筛选得到)用含10% 胎牛血清的RPMI-1640培养基于37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养，取对数生长期细胞进行实验并根据实验需要分组。

2.2 Western blotting检测蛋白的表达水平 用细胞裂解液［20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)，150 mmol/L NaCl，0.25%NP40，2.5 mmol/L sodium pyprophosphate，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L βglycerophosphate，1 mmol/L Na3VO4，1 mmol/L PMSF，1 mg/L leupeptin］提取K562及K562/G细胞总蛋白。用考马斯亮蓝法进行蛋白定量后，等量蛋白上样，10%SDS-PAGE进行蛋白分离，将蛋白转移至硝酸纤维素膜，I抗孵育，4℃过夜，HRP标记的II抗孵育1 h，于暗室中曝光。以glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)作为内参照。

2.3 MTT法检测细胞增殖情况 K562及K562/G细胞培养于96孔板，分别进行不同的处理，检测前每孔加入20 μL MTT溶液，继续孵育4 h，离心弃上清液后，每孔加入150 μL DMSO溶解沉淀，于490 nm波长的酶标仪测定吸光度。

2.4 流式细胞术检测细胞周期 收集细胞后，1 500 r/min离心5 min，PBS洗涤2次，后用70% 冰乙醇固定过夜，碘化丙啶 (propidium iodide，PI)染色后流式细胞仪测定细胞周期。

2.5 甲基纤维素克隆形成实验 对照组及药物处理组细胞(K562及K562/G)分别培养于甲基纤维素中，37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养6 d后显微镜下观察克隆。

2.6 Annexin V-PI染色检测细胞凋亡 K562及K562/G细胞分别进行不同的处理，检测前每孔用500 μL binding buffer 重悬，加入 5 μL Annexin VFITC及5 μL PI，避光孵育15 min后流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

3 统计学处理

数据用SPSS 16.0统计软件分析，数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较分析用t检验或方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 伊马替尼对K562及K562/G细胞的作用

将K562及K562/G细胞培养于96孔板，分别用不同剂量(0、0.1、0.5、1、5、10 μmol/L)的伊马替尼进行处理，48 h后MTT法检测细胞的增殖情况。与对照组相比，伊马替尼可剂量依赖性地抑制K562及K562/G细胞的增殖。K562细胞对伊马替尼较敏感，而K562/G在同样剂量的伊马替尼处理下出现耐药。1 μmol/L的伊马替尼作用下，K562细胞的存活率是53.9% ±2.0%，K562/G的存活率为77.4% ±5.9%(P＜0.01)，见图1A。Western blotting实验结果显示，K562/G细胞比K562细胞表达更高的c-Myc蛋白，见图1B。

2 c-Myc抑制剂10058-F4对K562及K562/G细胞增殖及周期的影响

由于c-Myc在K562/G细胞中具有较高的表达，为了验证c-Myc靶向抑制剂10058-F4对耐药细胞的作用，10058-F4 以不同浓度(0、25、50、100 μmol/L)及不同时间(0、24、48、72 h)作用于K562及K562/G细胞，MTT法分析10058-F4对白血病细胞的增殖抑制作用。结果显示:与对照组相比，10058-F4对K562及K562/G细胞均有抑制作用，且呈剂量和时间依赖性，并且对耐药的K562/G细胞较K562细胞抑制作用更强，耐药细胞对10058-F4更敏感，见图2。50 μmol/L的10058-F4作用48 h，K562及K562/G细胞的存活率分别为73.3%±3.2%及63.7%±3.0%;100 μmol/L 的 10058-F4 作用 48 h，K562 及K562/G细胞的存活率分别为61.7%±3.6%及42.0%±3.2%，与对照组相比均具有显著差异(P＜0.01)。流式细胞术检测K562及K562/G细胞周期结果显示，10058-F4能阻滞细胞于G0/G1期(图3)，因此10058-F4对细胞增殖的抑制作用可能与细胞周期的阻滞相关。

Figure 2.10058-F4 inhibited proliferation of K562 and K562/G cells.A:K562 and K562/G cells were treated with various concentrations of 10058-F4 for 48 h and then subjected to MTT assay;B:K562 and K562/G cells were treated with 50 μmol/L 10058-F4 for indicated time and then subjected to MTT assay.Mean±SD.n=3. ＊＊P ＜0.01 vs 0 μmol/L or 0 h.图2 10058-F4抑制K562及K562/G细胞的增殖

3 c-Myc抑制剂10058-F4促进K562及K562/G细胞凋亡

100 μmol/L的10058-F4处理 K562及 K562/G细胞48 h后，Annexin V-PI染色并采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，结果表明10058-F4可促使K562及K562/G细胞发生凋亡，见图4。

4 c-Myc抑制剂10058-F4对K562及K562/G细胞克隆形成能力的影响

克隆形成实验结果显示，相对于K562细胞，K562/G细胞表现出更强的克隆形成能力(P＜0.01)，见图5。伊马替尼对于K562细胞的抑制作用明显大于K562/G细胞(P＜0.01)，进一步表明K562/G细胞对伊马替尼的耐药性。10058-F4可抑制K562及 K562/G细胞的克隆形成能力，且对K562/G细胞的作用更加显著(P＜0.01)。10058-F4与伊马替尼联合作用于细胞6 d后，两药联用组比对照组及单药组作用效果更加明显，提示10058-F4可以逆转K562/G细胞对伊马替尼的耐药性。

Figure 3.10058-F4 induced cell cycle arrest in K562 and K562/G cells.K562 and K562/G cells were treated with 50 μmol/L 10058-F4 for 48 h and then subjected to flow cytometry for cell cycle analysis.Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs control.图3 10058-F4导致K562及K562/G细胞周期阻滞

讨 论

作为肿瘤治疗的潜在靶点，c-Myc在人类多种实体肿瘤及血液肿瘤中异常高表达。研究报道，c-Myc的异常表达可促进肿瘤的形成和进展［7］;抑制c-Myc的表达可抑制肿瘤细胞生长，促进细胞凋亡、衰老和分化。更重要的是，c-Myc的高表达在白血病发生过程中起关键的作用［8］，抑制c-Myc能够阻止白血病的发生［9］。c-Myc通过调节一系列下游基因决定细胞的存活。c-Myc在CML患者的CD34+造血前体细胞中通过调控ATP-binding cassette(ABC)转运蛋白的基因转录从而导致细胞对化疗药物的耐药［10］。另外，c-Myc可调节多种micro RNA，包括增加促进肿瘤发生的microRNA及降低肿瘤抑制作用的micro-RNA的表达。在K562细胞中，c-Myc可通过调控miR-144/451的表达使K562细胞获得对伊马替尼的抗药性［11］。

Figure 4.10058-F4 induced apoptosis of K562 and K562/G cells.K562 and K562/G cells were treated with 100 μmol/L 10058-F4 for 48 h and then subjected to flow cytometry for Annexin V-PI analysis.Mean±SD.n=3. ＊＊P ＜0.01 vs control.图4 10058-F4促进K562及K562/G细胞发生凋亡

本研究发现c-Myc表达上调是耐药细胞克隆形成能力增强的细胞遗传学特征之一，c-Myc的高表达可能导致K562/G细胞对于伊马替尼的敏感性降低。c-Myc抑制剂10058-F4可抑制K562及K562/G细胞的增殖，并且对K562/G细胞表现出更强的杀伤作用，可能与其高表达c-Myc相关。细胞周期检测显示10058-F4能阻滞细胞于G0/G1期，因此10058-F4抑制细胞增殖可能与细胞周期阻滞相关，与之前的研究结果一致［6］。同时，10058-F4可促进K562及K562/G细胞发生凋亡。此外，细胞克隆形成实验显示，K562/G细胞对10058-F4具有更高的敏感性。在肝癌［5］、肺癌［12］及黑色素瘤［13］的研究中，抑制 c-Myc的表达可增强细胞对化疗药物的敏感性。我们的研究发现10058-F4可恢复耐药K562/G细胞对于伊马替尼的敏感性，减少细胞的克隆形成数目。因此，高表达c-Myc的K562/G细胞可能通过上调c-Myc的表达增强对伊马替尼的抵抗作用，提高细胞的耐药性。10058-F4作为一个有效的c-Myc的小分子抑制剂，可杀伤白血病细胞，逆转耐药。

Figure 5.10058-F4 supressed colony formation of K562 and K562/G cells.K562 and K562/G cells were treated with 50 μmol/L 10058-F4 or/and 1 μmol/L imatinib for 6 d and subjected to colony formation analysis(×100).＊＊P＜0.01 vs K562;##P＜0.01 vs imatinib.图5 10058-F4抑制K562及K562/G细胞的克隆形成能力

本实验初步分析了c-Myc对CML耐药细胞特性的影响。结果表明c-Myc在CML细胞耐药性中起重要作用，c-Myc的小分子抑制剂可有效杀伤K562细胞及伊马替尼耐药的K562/G细胞，预示通过抑制c-Myc的表达可以克服CML治疗过程中的耐药问题，为临床提供新的治疗策略。

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