高效液相色谱法测定盐酸瑞伐拉赞的有关物质

蒲小琴 ，曾 巧 ，徐 溢

(1．重庆科技学院，重庆 401331;2．重庆大学，重庆 400030;3．重庆医药工业研究院有限责任公司，重庆 400061)

盐酸瑞伐拉赞(revaprazan hydrochloride)为新一代可逆质子泵抑制剂(PPI)，也是全球唯一上市的钾竞争性酸泵抑制剂或酸泵拮抗剂，主要用于治疗十二指肠溃疡和胃炎、急性胃炎、慢性胃炎以及胃癌病灶的改善和短期治疗消化性溃疡。与传统PPI不同的是，其通过竞争性抑制质子泵(即H+，K+－ATP酶)中的K+而起作用，是一种可逆的钾拮抗剂。由于盐酸瑞伐拉赞抑酸效果和质子泵活化情况无关，临床可明显减少夜间酸突破的发生。同时，由于其具有亲脂性、弱碱性、解离常数高和在低pH时稳定的特点，故在酸性环境下立刻离子化，通过离子型结合抑制H+，K+－ATP酶，不需要集中于胃壁细胞的微囊和微管及酸的激活，能迅速升高胃内pH，而在离解后酶活性能得到有效的恢复，在治疗剂量时对其他酶影响很小，对机体生理功能的影响也非常小。盐酸瑞伐拉赞对胃消化性溃疡具有良好的治疗作用和较少的不良反应，在消化性溃疡领域的潜力及市场需求将非常巨大[2－4]。通过文献及专利检索发现，国内外的文献及专利资料中，仅有1篇报道采用高效液相色谱(HPLC)法测定其体外溶出度[5]，1篇报道采用液－质联用(LC－MS)方法测定其血浆药物浓度[6]，未见有杂质控制方面的报道。盐酸瑞伐拉赞中可能含有3种杂质(杂质A、杂质B、杂质C)，有关物质是影响产品质量及安全性最重要的指标，故建立一种能有效控制产品中有关物质含量的检测方法势在必行。本研究中针对此新型化合物开发有关物质的质控方法，以高效液相色谱系统为测试体系，建立了以磷酸氢二钠－乙腈为分离体系、高灵敏度的有关物质测定方法，现报道如下。

1 仪器与试药

Dionex U3000型高效液相色谱仪(多波长紫外检测器)，Chromeleon色谱工作站(Dionex公司);Agilent 8453型紫外－可见分光光度计;电子天平(Mettler Toledo公司);PB－10精密pH计(德国赛多利斯公司)。盐酸瑞伐拉赞(批号为 RF2014001，RF2014002，RF2014003)，杂质 A(1 － 甲基 －1，2，3，4 － 四氢异喹啉，批号为 YKL－201402001)，杂质 B[4－羟基 －2－(4－氟苯胺)－5，6－二甲基嘧啶，批号为 QJ－201402001]，杂质 C[4－氯 －2－(4－氟苯胺)－5，6－二甲基嘧啶，批号为 LD－201402001]均由重庆福美达科技有限公司提供，结构式见图1[7－9];磷酸氢二钠、磷酸为分析纯，乙腈为色谱纯，水为超纯水。

图1 盐酸瑞伐拉赞及其杂质化学结构式

2 方法与结果

2．1 色谱条件

色谱柱:Inertsil－ C8柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm);流动相:0．01 mol/L磷酸氢二钠溶液(用磷酸调pH为4．0)－乙腈(30∶70);检测波长:205 nm;流速:1．0 mL/min;柱温:35 ℃;进样量:10 μL。理论板数以瑞伐拉赞峰计不得低于5 000，主峰与相邻杂质峰的分离度应大于1．5。

2．2 溶液制备

取盐酸瑞伐拉赞适量，加70%乙腈水溶液溶解并稀释制成质量浓度为0．6 g/L的溶液，即得供试品溶液。精密量取供试品溶液0．5 mL，置100 mL容量瓶中，加70%乙腈水溶液稀释至刻度，摇匀，即得对照溶液(约 3 μg/mL)。

2．3 测定法

精密量取对照溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的10% ～20%。再精密量取供试品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，同时做溶剂空白试验。供试品溶液中如显杂质峰，以峰面积按稀溶液自身对照法进行计算。

2．4 方法学考察

2．4．1 系统适用性试验

分别精密称取杂质A，B，C及盐酸瑞伐拉赞适量，加70%乙腈水溶液溶解并稀释制成每1 mL中约含0．6 mg盐酸瑞伐拉赞、12 μg杂质A，12 μg 杂质 B，12 μg质杂 C 的混合溶液，作为系统适用性试验溶液。精密量取10 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。理论板数以瑞伐拉赞峰计为13 500，主峰与各杂质峰、各杂质间的分离度均大于 1．5(分离度 r=6．48，16．99，17．62)，见图2。

图2 高效液相色谱图

2．4．2 专属性试验

对本品分别进行强酸、强碱、高温、强氧化、强光照的降解试验(供试品溶液质量浓度约为0．6 g/L)，考察盐酸瑞伐拉赞与各降解产物的分离情况，同时也考察盐酸瑞伐拉赞在各条件下的稳定性。结果见图3。可见，各降解条件下的降解产物均能与盐酸瑞伐拉赞达到基线分离，不干扰有关物质测定，且杂质之间也得到了较好分离，阴性无干扰。该方法专属性强，适用于盐酸瑞伐拉赞中有关物质的测定。另外，盐酸瑞伐拉赞对强碱、强光照、强氧化条件均较稳定，强酸条件下略有降解，较高温度条件下较其他条件更敏感。

2．4．3 检测限及定量限试验

取盐酸瑞伐拉赞适量，加70%乙腈水溶液溶解并稀释制成质量浓度为1 μg/mL(相当于供试品溶液的0．2%)的供试品溶液。精密量取10 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，同时采集基线噪声，以3倍噪声计算检测限，10倍噪声计算定量限。检测限为 0．09 μg/mL(S/N=3，相当于供试品溶液的 0．015%)，定 量 限 为 0．30 μg/mL(S/N=10，相 当 于 供 试 品 溶 液 的0．05%)。

2．4．4 精密度试验

精密量取对照品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，连续进样6次，以峰面积计算 RSD。结果的 RSD为0．81%，表明仪器精密度好。

2．4．5 线性关系考察

取本品适量，用70%乙腈水溶液稀释配制成质量浓度为0．3，0．6，1．2，3．0，5．0，6．0 μg/mL 的系列溶液，分别相当于供试品溶液的 0．05% ，0．10% ，0．20% ，0．50% ，0．80% ，1．0% 。精密量取上述溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归，得线性回归方程 A=2．186 6+41．940 2 C，r=0．999 8(n=6)。结果表明，稀溶液质量浓度在0．3～6 μg/mL范围内与峰面积呈良好线性关系，符合稀溶液自身对照法的测试要求。

图3 专属性试验高效液相色谱图

2．4．6 稳定性试验

精密量取同一供试品溶液，分别于 0，6，9，12，18，24 h 时精密量取10 μL，注入高效液相色谱仪，以峰面积归一化法计算有关物质。结果供试品溶液主峰面积的 RSD为1．86%，单个杂质的RSD为8．45%，总杂质的 RSD为8．90%，表明供试品溶液在24 h内相对稳定。

2．4．7 重复性试验

取盐酸瑞伐拉赞适量，依法制备供试品溶液与对照溶液，按拟订色谱条件进样测定，重复6次。结果单个杂质的 RSD为5．71%，总杂质的 RSD为6．35%，表明方法重复性良好。

2．4．8 耐用性试验

色谱柱:取高温降解试验供试品溶液，分别选用两根不同的Inertsil－C8柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm)，按拟订色谱条件进行测试。结果在不同编号的Inertsil－C8色谱柱上理论板数及分离度无明显变化，理论板数均大于5 000，分离度均大于1．5，表明方法对色谱柱的耐用性好。

缓冲液pH:取高温降解试验供试品溶液，分别在缓冲液pH为 3．9，4．0，4．1 的条件下，按拟订色谱条件进行测试。结果在不同pH的缓冲液条件下理论板数及分离度无明显变化，理论板数均大于5 000，分离度均大于1．5，表明方法对pH的耐用性好。

柱温:取高温降解试验供试品溶液，分别在柱温为30，35，40℃条件下，按拟订色谱条件测试。结果在不同柱温条件下理论板数及分离度无明显变化，理论板数均大于5 000，分离度均大于1．5，表明本方法对柱温的耐用性好。

流动相比例:取高温降解试验供试品溶液，分别在磷酸氢二钠－乙腈比例为35∶65，30∶70，25∶75的条件下，按拟订色谱条件进行测试。结果在不同的流动相比例条件下理论板数及分离度无明显变化，理论板数均大于5 000，分离度均大于1．5，表明方法对流动相在一定范围内比例变化的耐用性好。

2．5 样品测定

按拟订色谱条件，对3批盐酸瑞伐拉赞进行有关物质测定，结果表明，建立的方法可满足实际分析的需要，见表1。3批样品中杂质A，B，C均未检出，单一未知杂质均小于0．15%，总杂质均小于 0．3%。

表1 3批样品有关物质测定结果

3 讨论

检测波长的确定:根据盐酸瑞伐拉赞的紫外光谱图可知，其在205，271，304 nm波长处均有特征吸收峰，故在此3个波长条件下同时对供试品溶液进行测定。测定结果显示，在205 nm波长条件下能更有效地检测产品中各微量杂质，特别是杂质A。通过专属性试验进一步证明，采用205 nm波长能有效检测各降解产物。因此，选择205 nm作为盐酸瑞伐拉赞中有关物质的测定波长。

流动相的确定:以磷酸盐缓冲液(pH为2．5～7．0)进行试验，发现缓冲液pH为4．0时峰形对称、柱效最高，且以磷酸氢二钠为缓冲液效果最佳。以甲醇、乙腈为有机相进行了试验，以乙腈为流动相效果更好。因此，选择磷酸氢二钠－乙腈为流动相可行。

进样量的确定:取含0．6 g/L的盐酸瑞伐拉赞溶液，分别进样8，10，20 μL，供试品溶液中杂质检出量基本一致。且当进样量为10 μL时，检测限达到了0．015%，灵敏度满足测试要求，故选择10 μL作为进样量。

本试验中建立了测定盐酸瑞伐拉赞中有关物质的高效液相色谱法，该方法灵敏度高、专属性强、准确度高，能快速同时测定盐酸瑞伐拉赞中3个已知杂质及其他未知杂质，满足质控的要求。其自主开发的首创性为该产品的质量控制及质量研究奠定了基础。

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