复方黄龙胶囊对凝血、纤溶功能的影响

黎渊弘 ，刘言香 ，莫冬梅，钟小斌

（1.广西医科大学第一附属医院药剂科，广西 南宁 530021； 2.广西医科大学药学院，广西 南宁 530021）

复方黄龙胶囊是由黄芪、赤芍、川芎、当归尾、地龙、红花、桃仁、水蛭、川牛膝提取物制备而成的医院制剂。现按中药六类医院制剂进行临床前药效学试验，深入研究其抗凝和纤溶作用，报道如下。

1 仪器、试药与动物

仪器:AR1140/C型电子分析天平（奥豪斯国际贸易＜上海＞有限公司）；LDZ4-0.8型自动平衡微型离心机（北京医用离心机厂）；B11241-89型电热恒温水浴箱（北京医疗设备厂）；DU-3300PC型紫外可见光分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；ACL-Advace全自动血凝仪（美国IL公司）。

试药:复方黄龙胶囊（广西医科大学第一附属医院制剂室，自制）；注射用尿激酶（广东天普生物化学制药有限公司，批号为20120709）；戊巴比妥钠（上海化学试剂采购供应站分厂，批号为2012-05-08）。活化部分凝血活酶时间（APTT）测定试剂盒、凝血酶原时间（PT）测定试剂盒、凝血酶时间（TT）测定试剂盒（均为上海太阳生物技术有限公司，批号为1121121）；冻干人纤维蛋白原（上海莱士血液制品股份有限公司，批号为20070121AO）；凝血酶（河南中泰药业有限公司，批号为20100503）。

动物:家兔，体重 2.0 ～2.5 kg；Wistar大鼠，体重 200 ～300 g。动物雌雄兼用，均由广西医科大学实验动物中心提供，动物合格证号为SCXK桂2009-0002。

2 方法与结果

2.1 体外凝血时间测定

给药组取复方黄龙胶囊提取物0.1 mL（含生药60 mg），对照组加生理盐水0.1 mL，分置两支试管中，各加1 mL家兔动脉血，观察凝血时间共 10次。结果对照组凝血时间为（36.40±12.62）s，给药组为（419.60±66.52）s。复方黄龙胶囊能明显延长动物体外凝血时间(P ＜0.05)。

2.2 血块溶解时间测定

取家兔动脉血2 mL，置试管内12 h自然凝固后，取出血凝块，一分为二，用滤纸吸干后称重，分放两支试管内；一支作为给药组，加复方黄龙胶囊提取物0.1mL（含生药60mg）；另一支作为对照组，加生理盐水 0.1mL）。1.5 h后取出剩余血块，吸干称重。结果见表1。可见，复方黄龙胶囊能明显溶解血块，溶解体外块。

表1 复方黄龙胶囊对体外血块溶解的作用（n＝10，±s）

表1 复方黄龙胶囊对体外血块溶解的作用（n＝10，±s）

注:t检验，与对照组比较，P ＜0.05。

组别对照组给药组质量浓度（g /L）0 0.0 6血块湿重（mg）溶解前1 0 0 1 0 0溶解后7 7.3 2 ±3.3 5 2 5.7 8 ± 4.9 1溶解率（%）2 2.6 8 ± 3.3 5 7 4.2 2 ± 4.9 1

2.3 优球蛋白溶解时间测定[1]

体外法:分离枸橼酸钠抗凝血浆，取离心管4支，分别加入蒸馏水 7.5 mL，加 0.17 mol/L 乙酸 0.12 mL，置冰水浴（4 ℃ ）中10min；水浴10min后加入0.5mL血浆混匀，继续置冰水浴10min，以3 000 r/min转速离心15 min；倾去上清液，倒置离心管于滤纸上，吸去残余液体；加入硼酸钠缓冲液0.5 mL于沉淀中，置37℃水浴中，轻轻搅动使之溶解；加入 0.025 mol/L CaCl25 mL，静置凝结成凝块；凝固后，给药组加入不同质量浓度的复方黄龙胶囊提取物，对照组加入生理盐水，置于37℃水浴中，记录凝块完全溶解的时间。

体内法:取大白鼠30只，分为大剂量组（含生药6 g/kg）、小剂量组（含生药3 g/kg）和对照组（等体积生理盐水）3组，每组10只，分别灌胃给药7 d；按以上体外法制得凝块，分别置凝块于37℃水浴中，记录凝块完全溶解的时间。

结果见表2。可见，复方黄龙胶囊体外溶解优球蛋白的效果明显；体内虽能溶解优球蛋白，但溶解效果不如体外。

表2 大白鼠体内外优球蛋白溶解时间测定（n＝10，±s）

表2 大白鼠体内外优球蛋白溶解时间测定（n＝10，±s）

注:t检验，与对照组比较，P ＜0.01。

体外 体内组别剂量（g /k g）对照组大剂量组小剂量组质量浓度（g /L）-0.6 0.3溶解时间（h）4.7 1 ± 0.5 1 1.6 8 ± 0.2 8 1.8 1 ± 0.1 3-6 3溶解时间（h）凝块不溶解5.6 3 ± 0.6 9 7.4 4 ± 0.7 9

2.4 抗凝效应试验

体外法:由人肱动脉抽血，用3.8%枸橼酸钠抗凝，血液与抗凝剂之比为 9∶1，以 4 000 r/min转速离心 15 min，取上清液，即为贫血小板血浆。给药组取复方黄龙胶囊提取物0.1mL(含生药60 g)，对照组取生理盐水0.1 mL，分别加入以上述方法制备的贫血小板血浆 0.1 mL，混匀，然后取 0.1 mL，按 APTT，PT，TT试剂盒说明书进行凝血时间测定。

体内法:取大白鼠30只，分为复方黄龙胶囊大、小剂量组和生理盐水（对照组）3组，给药组按大剂量（含生药 6 g/kg）、小剂量（含生药 1.6 g/kg）给药，对照组给予等量生理盐水，灌胃给药7 d。给药 7 d后，腹腔动脉取血 2 mL，用 3.8%枸橼酸钠 9∶1抗凝，以 4 000 r/min 转速离心 10 min，分离血浆，按 APTT，PT，TT试剂盒说明书进行凝血时间测定。

结果见表3和表4。可见，复方黄龙胶囊在体内外均可使APTT，PT，TT显著延长（P ＜0.01）。

表3 复方黄龙胶囊体外对人血APTT，PT，TT的影响（±s，n＝10）

表3 复方黄龙胶囊体外对人血APTT，PT，TT的影响（±s，n＝10）

注:t检验，与对照组比较，P ＜0.01。

组别对照组大剂量组中剂量组小剂量组质量浓度（g /L）-1 6 8 4 A P TT（s）3 9.1 0 ± 6.2 3 3 6 0.0 0 ±0.0 0 2 2 5.7 0 ±2 8.6 6 9 3.8 0 ± 1 2.0 6 P T（s）1 7.3 0 ±2.1 1 1 8 0.0 0 ± 0.0 0 4 1.5 0 ±3.6 3 2 5.1 0 ±2.1 8 TT（s）1 4.4 0 ± 0.5 2 6 6.8 0 ± 7.5 7 3 0.6 0 ± 2.3 7 2 2.6 0 ± 1.7 1

表4 复方黄龙胶囊体内对大白鼠APTT，PT，TT的影响（±s，n＝10）

表4 复方黄龙胶囊体内对大白鼠APTT，PT，TT的影响（±s，n＝10）

注:t检验，与对照组比较，P ＜0.01。

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2.5 纤溶活性测定

纤溶活性测定采用纤维蛋白平板法[2]（标准平板和加热平板）。按需在平板上打直径为3 mm的小孔，每孔加不同质量浓度的尿激酶或复方黄龙胶囊提取物10μL（含生药0.1mg），置37℃保温18 h后，取出观察结果。结果见图1。可见，复方黄龙胶囊在普通平板和加热平板上都能溶解纤维蛋白（有溶圈）；而尿激酶在普通平板上有较强的纤溶作用，在加热平板上则无纤溶作用（无溶圈）。说明复方黄龙胶囊纤溶机制与尿激酶不同，是以直接纤溶为主。

图1 复方黄龙胶囊的纤溶活性测定

3 讨论

动脉血栓形成属中医的血瘀证范畴，以气虚血瘀症最常见，瘀阻经络是其主要矛盾，治疗应以化瘀通络为重点、补气为辅。自《黄帝内经》问世以来，防治血栓的方剂有百余种，在诸多成方中，黄芪、地龙、水蛭、川芎、牛膝这几味药的使用率高。据此，笔者在清代王清任《医林改错》中“补阳还五汤”的基础上，补加水蛭、川牛膝两味药材，目的在于加大祛瘀通络药物的比例，引血下行。复方黄龙胶囊由黄芪、赤芍、川芎、当归尾、地龙、红花、桃仁、水蛭、川牛膝组方方中重用黄芪，取其大补脾胃之元气，使气旺以促血行，祛瘀而不伤正，并助诸药之力，为君药；配以当归尾，有祛瘀而不伤好血之妙，为臣药；川芎、赤芍、红花、桃仁、助当归尾活血化瘀，地龙、水蛭、川牛膝通经活络，均为佐使药。全方功能补气、活血、通经络。

现代医学研究表明，黄芪[3]能降低血液的高凝状态，使糖尿病大鼠的全血黏度、血浆黏度、红细胞压积以及血小板聚集率均显著降低。阿魏酸[4]是当归的有效成分之一，能有效抑制血小板聚集，抑制5-羟色胺、血栓素样物质的释放和血栓素合成酶的活性，使前列腺素和血栓素的比例升高，从而发挥抗血栓作用。赤芍[5]能抑制血小板聚集，改善红细胞的通透性，增加红细胞对低渗张力的抗性，有一定稳定红细胞膜结构的作用。另外，赤芍总苷能明显延长大鼠和小鼠的凝血时间。地龙含有蚓激酶[6]，能直接水解纤维蛋白，并能间接激活纤溶酶原形成纤溶酶，起到纤溶酶原激活物的作用。水蛭[7]的药效成分水蛭素是迄今发现的作用最强的凝血酶抑制剂之一，能明显延长APTT，PT及TT，抑制凝血因子Ⅱ，Ⅷ，Ⅹ，Ⅻ的活性，具有很强的抗凝活性。川芎的有效成分川芎嗪[8]可保护血管内皮，阻断Ca2+对血小板的激活和前列腺素的代谢，显著减轻缺血再灌注损伤后内皮细胞与白细胞的黏附，促进血管内皮细胞释放一氧化氮（NO），从而抑制血小板聚集。红花[9]中的红花黄色素（SY）对内源性凝血和外源性凝血均有明显的抑制作用，可显著延长PT和TT，对凝血过程中的血小板黏附、血栓形成、纤维蛋白交联等均有抑制作用。桃仁[10]水提物、苦杏仁苷、桃仁脂肪油对二磷酸腺苷（ADP）诱导的血小板聚集都有不同程度的抑制作用，能显著降低由高分子右旋糖酐引起的家兔实验性高黏滞血症，并能降低红细胞的聚集性。牛膝[11]具有降低大鼠全血黏度、红细胞压积、红细胞聚集指数的作用，并能延长大鼠PT和血浆复钙时间，从而产生抗凝血作用。

本试验结果表明，复方黄龙胶囊在体内外均能明显延长人和大白鼠 APTT，PT，TT，缩短家兔的 BLT，ELT；在普通纤维蛋白平板和加热平板上能溶解纤维蛋白。因此，复方黄龙胶囊具有抗凝和纤溶双重作用，主要是由于其主要成分对凝血功能多个环节和多个靶点产生协同的抑制作用。

参考文献:

[1]杨春生，宋乃国.临床检验学[M].天津:天津科学技术出版社，1997:49.

[2]Astrup T，Müllerts.The fibrin platemethod for estimating fibrinolytic activity[J].Arch Biochem Biophys，1952，40（3）:346-352.

[3]钟焕桦.黄芪对糖尿病大鼠血糖和血液流变学特性的影响[J].汕头大学医学院学报，2005，18（2）:96-98.

[4]丁玲岩，刘现亮.阿魏酸钠与心血管疾病[J].国际心血管病杂志，2008，35（4）:242-243.

[5]徐先祥，夏伦祝，高家荣，等.黄芪总苷和赤芍总苷协同抗血小板作用研究[J].中药材，2002，25（9）:653-655.

[6]王承利，张 贺，王 洋，等.蚓激酶研究进展[J].动物医学进展，2009，30 （11）:86-90.

[7]黄爱民，黎肇炎，瘳共山，等.菲牛蛭素体内外抗凝实验研究[J].广西医科大学学报，2006，23（1）:30-32.

[8]姜 宏，施广飞，朱 珠，等.川芎嗪对心血管作用研究进展[J].中国临床药理学与治疗学，2007，12（5）:484-487.

[9]杨晓君，吴桂荣 .红花的现代研究 农垦医学，2004，26（4）:301-304.

[10]汪 宁，刘青云，彭代银，等.桃仁活血化瘀作用的研究进展[J].安徽中医学院学报，2002，21（3）:63.

[11]李学林，李 威，陈国华，等.牛膝活血作用的实验研究[J].中医研究，1990，3（2）:27.