利拉鲁肽对糖尿病大鼠肾脏病变的影响

李 里，卢 松

（重庆市中山医院内分泌科，重庆 400013）

糖尿病肾病（DN）是常见的糖尿病微血管并发症，目前被认为是导致终末期肾衰竭的主要原因[1]。利拉鲁肽是一种胰高血糖素样肽-1（GLP-1）类似物，2型糖尿病患者 GLP-1分泌功能受损，外源性给予利拉鲁肽可明显降低其血糖及体重，故该药受到的关注越来越多。目前，关于利拉鲁肽对糖尿病肾病（DN）的影响研究少见报道。本研究中，拟从白蛋白排泄率、生化、病理等方面观察不同剂量利拉鲁肽对糖尿病大鼠肾脏病变的影响。现报道如下。

1 材料和方法

1.1 动物模型的建立与分组

选择雄性8周龄SD大鼠60只（购自重庆医科大学医学动物中心），体重（200 ±25）g，动物合格证编号为 150449。2 型糖尿病模型制备，采用高糖高脂饮食1个月后一次性小剂量链脲佐菌素（STZ，Sigma公司）（30 mg/kg）腹腔内注射[2]，STZ 用 0.1 mmol/L 无菌枸橼酸缓冲液配制（pH＝4.5）。给药72 h后连续3 d血糖不低于16.67mmol/L，尿糖定性（++）以上者视为造模成功。将 30只成模大鼠随机平均分为3组，即糖尿病肾病组（DN组）、利拉鲁肽100μg/kg组（L100 组）、利拉鲁肽 200μg/kg组（L200组）。另取10只SD大鼠，腹腔注射等量枸橼酸钠缓冲液，作为正常对照组（NC组）。模型建立1周后，L100组、L200组分别给予利拉鲁肽（诺和诺德中国公司）100μg/kg或 200μg/kg腹腔内注射，每日2次，NC组与DN组给予等量生理盐水注射。

1.2 标本收集与测定

药物干预12周后，以代谢笼收集24 h尿液，记录尿量并采用散射比浊法测定尿白蛋白排泄率（UAER）。24 h尿蛋白测定采用考马斯亮兰法，以牛血清蛋白制作标准曲线，得回归方程 Y＝3.729 7 ×10-4X+0.397 7（r＝0.999 7），将每个标本于 721 型分光光度计595 nm波长处测得的吸光度（A）值代入上述方程，所得值与尿量的乘积为24 h尿蛋白总量。称体重（BW）后，腹主动脉取血、离心，使用法国ABX型全自动生化分析仪检测血糖（BG）、血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）。采血后分离左肾，去包膜，称肾重（KW），计算肾脏肥大指数 （KW/BW×103）。

1.3 肾脏病理检查

取部分肾组织，经4%戊二醛固定，常规脱水、渗透、包埋、切片等处理，透射电镜观察肾脏组织超微结构变化。取部分肾组织，予4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片、脱蜡、HE及PASM染色、透明、封片处理，光镜观察肾脏组织结构变化。在光镜下（400倍）随机取50个肾小球，用北航计算机医学病理图像分析系统测定肾小球平均截面积（MGA）、系膜平均面积（MMA），根据肾小球平均体积（MGV）＝1.25MGA 计算 MGV，系膜面积比（FMA）＝MMA/MGA。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 血糖、肾功能指标

试验结束，DM组死亡3只，L100组与L200组各死亡1只。与 DM 组比较，L100组与 L200组的 BUN，Scr，UAER，BG水平均明显下降（P ＜0.05），L200组比 L100组下降更明显（P ＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血糖、肾功能指标水平变化（±s）

表1 各组大鼠血糖、肾功能指标水平变化（±s）

注:与 NC 组比较，P ＜0.05；与 DM 组比较，P ＜0.05；与 L100 组比较，P ＜0.05。下表同。

组别N C组（n＝1 0）D M 组（n＝1 2）L 1 0 0组（n＝1 4）L 2 0 0组（n＝1 4）B U N（m m o l/l）4.8 1±1.2 8 9.7 6±1.9 6 7.6 4±0.8 9 6.7 6±0.8 9 S c r（ m o l/L）5 3.8 6 ±5.1 2 9 3.8 6 ±1 1.3 1 7 8.2 8 ±1 0.1 2 6 8.7 6 ±7.4 3 U A E R（mg/2 4 h）2.7 8 ±0.1 0 7.8 7 ±0.5 7 5.4 4 ±0.3 7 4.1 4 ±0.2 8 B G（m m o l/L）5.4 9±0.6 9 1 8.3 8 ±4.0 1 9.6 4±3.8 9 8.1 5±2.1 1

2.2 肾脏肥大指标

与 DM组比较，L100组与 L200组 KW，KW/BW，MGV，FMA增加的幅度明显下降（P＜0.05），L200组比 L100组下降更明显（P ＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠肾脏肥大指标变化（±s）

表2 各组大鼠肾脏肥大指标变化（±s）

组别N C组（n＝1 0）D M 组（n＝1 2）L 1 0 0组（n＝1 4）L 2 0 0组（n＝1 4）K W（g）1.7 8 ± 0.1 8 4.4 8 ± 0.3 7 3.6 5 ± 0.2 5 3.0 8 ±0.3 2 K W /B W（1 0-3）3.2 7 ± 0.2 6 5.8 7 ± 0.2 1 4.6 6 ± 0.4 4 4.1 5 ± 0.3 5 mg V（1 0 6 m 3）0.5 2 6 ± 0.0 2 0.8 5 6 ± 0.0 2 0.7 2 7 ± 0.0 5 0.6 8 6 ± 0.1 2 F M A 0.2 1 ± 0.0 1 0.5 8 ± 0.0 2 0.4 3 ± 0.0 6 0.3 6 ±0.0 6

2.3 肾组织病理学检查

光镜下，HE及PASM染色显示，对照组大鼠肾组织结构清晰、形态规则、毛细血管基底膜（ECM）清晰可见，包曼氏囊清晰可见；DM组大鼠肾小球明显肥大，部分肾小球呈分叶状，系膜区增宽，基底膜增厚；L100组和L200组也出现上述改变，但程度明显减轻，尤以L200组病变减轻明显。见图1及图2。透射电镜结果显示NC组大鼠肾组织结构清晰，基底膜光滑、均质，足突间隙明显；DM组大鼠肾小球足细胞胞体肿胀，足突部分融合、脱落，系膜区基质增多，基底膜增厚；L组上述改变减轻，尤以L200组病变减轻明显。见图3。

图1 光镜下大鼠肾脏HE染色图像（400倍）

图2 光镜下大鼠肾脏PASM染色图像（400倍）

图3 大鼠肾脏透射电镜图像（10 000倍）

3 讨论

糖尿病肾病特征性病理改变是系膜细胞肥大以及细胞外基质成分堆积，肾小球基底膜增厚，最终导致肾小球硬化。其发病机制复杂，而高血糖是其发生发展的起始和核心因素。在肾脏中，长期高血糖状态可使肾小球上皮细胞分泌CD26增加[3]，导致肾脏局部血管内皮生长因子、转化生长因子、胰岛素样生长因子等表达增加，刺激系膜外基质沉淀，从而引起肾小球基底膜增厚，导致肾损害[4]。

利拉鲁肽是胰高血糖素样肽-1类似物，是治疗糖尿病的新型药物，通过抑制胰岛β细胞凋亡、促进其增殖及前体细胞向β细胞转化、抑制肝糖输出、促进外周细组织对胰岛素的敏感性，从而降低血糖。本研究结果显示，与糖尿病组大鼠相比，不同剂量利拉鲁肽治疗组大鼠血糖均明显降低，且肾功能各项指标如尿素氮、肌酐好转，24 h尿蛋白明显下降，病理切片分析和电镜检查提示肾小球基底膜增厚、系膜细胞增生、足细胞损伤等病理改变减轻，MGV及 FMA等病理指标好转，表明利拉鲁肽对糖尿病大鼠肾脏有保护作用，能减轻肾小球高滤过和肾脏肥大，降低尿蛋白，改善肾功能，且200μg/kg剂量较100μg/kg的作用更显著。但关于利拉鲁肽的剂量与保护肾脏的疗效是否成简单的线性关系，以及达到肾脏保护作用的起始剂量，仍需要进一步研究。

关于利拉鲁肽减少蛋白尿、延缓肾功能恶化的机制，目前进行的研究甚少。Chow等[5]通过db/db糖尿病小鼠研究了肾脏巨噬细胞浸润与肾损害的关系，发现肾脏巨噬细胞浸润与血糖、糖化血红蛋白水平明显相关，而与肥胖和血脂无关，肾脏巨噬细胞的浸润和激活与蛋白尿和肾纤维化则是相关联的。在STZ诱导的C57BL/6J小鼠DN模型中，肾脏巨噬细胞聚集同进行性肾损伤和纤维化是有联系的，糖尿病环境中的一些成分（如高血糖、糖化血红蛋白等）可以刺激巨噬细胞经由白细胞介素（IL-1）和血小板衍生生长因子（PDGF）依赖途径促进成纤维细胞增殖，从而可能增强肾纤维化[6]。因此推测，利拉鲁肽可能通过降低血糖、糖化血红蛋白水平，从而抑制巨噬细胞在肾脏局部的浸润，缓解蛋白尿和肾脏纤维化。

关于利拉鲁肽肾脏保护作用的机制、剂量和时间依赖性，以及是否具有降糖作用之外的肾脏保护作用等问题，有待进一步深入研究。

参考文献:

[1]Zhou G，Li C，Cai L.Advanced glycation end-products induce connective tissue growth factor-mediated renal fibrosis predominantly through transforming growth factor beta-independent pathway[J].Am JPathol，2004，165:2 033-2 043.

[2]何清华，周迎生，王 征，等.2型糖尿病大鼠模型制备的影响因素及其特点[J].中国实验动物学报，2007，15（6）:425-429.

[3]Mannucci E，Pala L，Ciani，et al.Hyperglycaemincrease diperptidy peptidase IV activity in patientswith type-2 diabetesmellitus[J].Diabetologia，2010，48:1 168.

[4]Cha DR，Kang YS，Han SY，et al.Vascular endot helial growthfactor is increased during early stage of diabetic nephropathy in type-2 diabetic rats[J].JEndocrinol，2011，183:183-194.

[5]Chow F，Ozols E，Nikolic-Paterson DJ，et a1.Macrophages inmouse type 2 diabetic nephropathy:correlation with diabetic state and progressive renal injury[J].Kidney Int，2009，65（1）:116-128.

[6]Chow FY，Nikolic-Paterson DJ，Atkins RC，et al.Macrophages instreptozotocin-induced diabetic nephropathy:potential role in renal fibrosis[J].Nephrol Dial Transplant，2010，19（12）:2 987-2 996.