京尼平预处理对脱矿牙本质胶原机械性能的影响

沙鑫家，王玉睿，周三玲，李 娜，刘瑞瑞

(第四军医大学口腔医院军事口腔医学国家重点实验室:1.特诊科;2.儿童口腔科;3.修复科，陕西 西安 710032)

牙本质粘结主要通过粘结树脂向脱矿牙本质表层的胶原纤维网渗透形成混合层和树脂突所提供的微机械嵌合力而获得粘结力，而以往实验证实，树脂－牙本质粘结界面混合层底部裸露胶原的降解可破坏粘结界面的封闭和稳定，是引起牙本质粘结界面老化，并进而导致粘结修复失败的主要原因之一［1］。Ⅰ型胶原作为牙本质有机基质的主要成分，凭借其天然交联状态所具有的黏弹性和稳定性而维持着牙本质有机结构。近年来，受组织工程医学中应用交联剂有效改性胶原支架材料的机械性能的启发，有学者尝试用富含天然交联剂京尼平的栀子提取物预处理脱矿牙本质，初步实验结果显示，京尼平预处理可增强脱矿牙本质的机械强度，有助于树脂牙本质即刻微拉伸粘结强度的提高［2］。但在以往的研究中，用于配制京尼平预处理剂的溶剂与现有粘结系统的溶剂类型不一致，预处理方法和时间不宜于临床应用［3］。故本实验配制与现有粘结系统溶剂一致的京尼平预处理剂用于牙本质酸蚀后、粘结前的预处理，观察不同溶剂配制的京尼平预处理剂对脱矿牙本质胶原交联度及极限拉伸强度的影响。

1 材料和方法

1.1 主要材料和仪器

富含京尼平(纯度＞95%)的栀子提取物(西安天本生工);蒸馏水、生理盐水、乙醇、丙酮、液氮、茚三酮(北京鼎国);常温离心机(SIGMA，美国);冷冻干燥机、电子天平(HITACHI，日本);低速切割机(NSK，日本);酶标仪(Bio－RAD，美国);万能测试机(Shimadzu，日本)。实验所用牙齿为30 d内拔除的无龋第三磨牙，贮存于4℃的5 g/L叠氮钠溶液中。

1.2 方法

1.2.1 京尼平预处理剂的配置

精确称取富含京尼平的栀子提取物粉，分别以蒸馏水、乙醇液、丙酮液作为溶剂，各配制成含京尼平重量体积百分浓度为5%、10%、15%的预处理剂;然后用NaOH滴定至pH=7.2备用。

1.2.2 京尼平预处理对胶原交联度影响的观察

1.2.2.1 脱矿牙本质试样的制备

取新鲜拔除的无龋第三磨牙10个，流水降温条件下用低速切割机截取其冠部牙本质，并制成厚度为1.0 mm的牙本质片。将所有牙本质片置于液氮中冷冻30 min后，用研钵磨成牙粉;然后筛选直径＜20 μm的牙粉置于100 g/L磷酸液中4℃下脱矿5 h;蒸馏水反复离心洗涤5次(4000 r/min，10 min)后，滤纸吸干，冷冻干燥备用。

1.2.2.2 实验分组和京尼平预处理

取上述脱矿后的牙本质粉分装于离心管中(每管1 mg)，并根据不同溶剂(蒸馏水、乙醇、丙酮)配置的京尼平预处理剂将其随机分为3个大组;每一个大组再根据京尼平浓度(5%、10%、15%)各随机分为3个亚组(共9组，每组3管)。然后按分组分别于每管中各加入5 mL相应的京尼平预处理剂，室温下处理60 s;蒸馏水反复离心洗涤后，冷冻干燥备检。

1.2.2.3 胶原交联度的测定

分别取预处理前(用于对照)和预处理后(各实验组)的牙本质粉试样置于20 mL试管中，每管加入300 μL蒸馏水并静置1 h后，再分别于每管中各加入 3 mL茚三酮试剂，100℃水浴加热20 min;待其冷却至室温时，每管各加入15 mL 600 mL/L的乙醇液并混匀。然后从每个试管中各吸取200 μL混合液，并以蒸馏水作为空白对照，分别在酶标仪上测其570 nm波长下的吸光度值;隔天重复测1次，所有操作均在暗室中进行。同时以甘氨酸系列标准液制作标准曲线，然后将各样本的吸光度值代入曲线计算其自由α氨基酸的量;并按以下公式计算其胶原的交联度。交联度(%)=(M0－Mt)/M0×100%。式中M0和Mt分别为京尼平处理前后牙本质粉中自由α氨基酸的量。

1.2.3 京尼平预处理对脱矿牙本质拉伸强度影响的观察

1.2.3.1 牙本质片试件的制备

取新鲜拔除的无龋第三磨牙30个，在流水降温下用低速切割机沿牙体长轴切取牙本质片，并将其修整成 0.5 mm(厚)×2.0 mm(宽)×8.0 mm(长)的长形试件(每个牙可制备6～8条)。然后用金刚砂车针在每个牙本质试件中心部位修整成“漏斗形”，中央颈部宽约0.5 mm，最终用精度为0.02 mm的游标卡尺测量并确定试件尺寸。

1.2.3.2 实验分组和京尼平预处理

取上述所有牙本质片试件，分别用100 g/L磷酸液4℃下脱矿5 h;蒸馏水反复离心洗涤5次(4000r/min，10 min)，滤纸吸干后用X射线检查各样本的脱矿情况。取脱矿完成的牙本质片试件180个，根据不同试剂、不同京尼平浓度将其随机分为9个实验组和3个溶剂(蒸馏水、乙醇、丙酮)对照组，每组15个试件。然后将9个实验组分别置于5 mL不同溶剂配制的不同浓度京尼平预处理剂中浸泡60 s;3个对照组分别置于3种溶剂中浸泡60 s，蒸馏水反复清洗后用于以下测试。

1.2.3.3 极限拉伸强度测试

取上述处理后的各组牙本质片试件，分别固定于测试底座上，用精度为0.02 N的万能测试机以0.5 mm/min的速度进行加载，直至牙本质断裂;分别记录各试件断裂时的最大载荷数值(N)，并计算其拉伸强度:极限拉伸强度=载荷数值/试件横截面积(MPa)。测试过程中保持试件湿润。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 京尼平预处理对胶原交联度的影响

蒸馏水、乙醇、丙酮3种溶剂配制的京尼平预处理剂对脱矿牙本质粉进行处理后，其胶原的交联度均随京尼平浓度的增加而增加，各浓度组间差异均有统计学意义(P ＜0.05);相同京尼平浓度组内不同溶剂相比，无论京尼平浓度是5%，还是10%或15%，其胶原的交联度均以乙醇溶剂组最高，蒸馏水溶剂组最低，各溶剂组间差异均有统计学意义(P ＜0.05)(表1)。

表1 不同预处理组胶原交联度比较(%，)

表1 不同预处理组胶原交联度比较(%，)

A、B、C为同溶剂组内不同浓度相比，d、e、f为同浓度组内不同溶剂相比;不同字母为P＜0.05

0.05 0.1 0.15蒸馏水 30.50 ±0.77Ad 41.09 ±1.20Bd 45.71 ±1.78溶剂 京尼平浓度(mg/mL)Cd乙醇 42.87 ±1.02Ae 45.62 ±0.93Be 55.98 ±2.05Ce丙酮 34.58 ±0.86Af 42.77 ±1.11Bf 49.51 ±1.60Cf

2.2 京尼平预处理对脱矿牙本质拉伸强度的影响

脱矿牙本质片试件分别经3种溶剂(蒸馏水、乙醇、丙酮)配制的京尼平预处理剂处理后，其极限拉伸强度均随着京尼平浓度的增加而增强，各浓度组间差异均有统计学意义(P＜0.05);相同京尼平浓度情况下，不同溶剂组的极限拉伸强度相比，各浓度组内各溶剂间的差异均无统计学意义(P ＞0.05)(表2)。

表2 不同预处理组试件的极限拉伸强度比较(MPa，)

表2 不同预处理组试件的极限拉伸强度比较(MPa，)

A～D为同溶剂组内不同浓度相比，a为同浓度组内不同溶剂相比;不同字母为P ＜0.05

0.05 0.1 0.15蒸馏水 12.70 ±2.17Aa 13.97 ±3.42Ba 20.56 ±3.15Ca 24.54 ±5.08溶剂 京尼平浓度(mg/mL)对照组Da Da乙醇 13.43 ± 3.71Aa 15.78 ±4.02Ba 21.04 ± 5.17Ca 24.69 ±3.29Da丙酮 14.47 ± 4.08Aa 15.31 ±3.78Ba 21.89 ± 3.65Ca 24.93 ±4.83

3 讨论

在以往的组织工程研究中，为了提高胶原支架的机械性能，常采用外源性交联剂对胶原进行化学交联改性，从而使胶原分子内部和分子之间通过共价键结合，以实现提高纤维张力和维持一定的拉伸强度［4］。在口腔粘结学领域，脱矿后裸露的牙本质胶原纤维网为交联剂的应用提供了作用靶点，如何改善粘结界面胶原网架的机械性能也就成为了直接影响牙本质粘结效果的关键。因此，国内外学者一直在探寻交联改性改进牙本质粘结界面的方法和材料。戊二醛是目前常用的一类交联剂，可在较短时间内完成对I型胶原的交联;但其具有一定的细胞毒性，并且能发生自聚而降低交联效率。本课题组前期研究发现，用京尼平交联体系处理牙本质粘结界面20 min后，可增强胶原纤维的交联程度，并使即刻粘结强度提高，表明京尼平是一种很有潜力的胶原交联体系。本结果显示，京尼平预处理剂不仅能呈浓度依赖性地增强胶原的交联度，还能显著提升胶原的极限拉伸强度，提示京尼平是一类效能较佳的牙本质粘结用胶原交联剂。

京尼平是一种纯天然植物的提取物，属于环烯醚萜类杂环化合物，关于其交联机理目前尚不甚清楚。有研究认为，明胶中只有伯胺能够与京尼平直接发生反应，伯胺通过亲核进攻京尼平的第三个碳原子，使京尼平开环形成醛基;随后仲胺基团通过攻击这个醛基而形成一个结构稳定的聚合物［5］。目前认为，京尼平与壳聚糖的交联过程是:壳聚糖分子的第二个碳原子上的氨基通过亲核进攻京尼平的第三个碳原子，导致二氢吡喃环打开并形成含氮的环烯醚萜，然后再脱水形成杂环中间体，中间体经聚合形成高度共轭的杂环京尼平衍生物;此外经SN2亲核取代反应显示，京尼平的酯键与壳聚糖的氨基发生取代反应后生成仲酰胺键，并形成一个聚合的环状结构［5］。以上结果表明，京尼平能够与含有氨基的化合物形成分子内和分子间的环状结构。而且京尼平与戊二醛在交联过程中形成的结构完全不同，戊二醛为网状的交联结构，而京尼平为环状的交联结构。提示，京尼平能够形成稳定、有效的交联结构，其抗降解能力较戊二醛好。

京尼平作为一种天然提取物，其生物学活性易受提取工艺、溶剂成分、pH值、工作浓度等因素的影响［6－7］，因此本实验选用与临床常用粘结剂一致的溶剂(乙醇和丙酮)配制京尼平预处理剂，以了解不同类型溶剂对京尼平交联性能的影响。结果显示，京尼平浓度和处理时间相同条件下，乙醇溶剂组和丙酮溶剂组的胶原交联度均明显高于水溶剂组。其原因可能是:乙醇和丙酮与溶质形成氢键的能力比蒸馏水低，当京尼平与该溶剂发生溶解作用时有更多的氢键形成位点空余，有助于其与脱矿牙本质胶原纤维作用时形成氢键，从而产生较强的交联作用［8－9］。提示，乙醇是一类较为合适的京尼平预处理溶剂。

综上所述，采用与现有粘结系统溶剂相同的京尼平预处理剂对脱矿牙本质进行处理，能显著促进牙本质胶原的交联，并进而提高其极限拉伸强度，且其效能呈浓度依赖性。但临床上应用京尼平进行预处理时，其应用方式尚需进一步深入探讨。

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