SPE-HPLC法同时测定荆防小儿止咳口服液中升麻素苷和连翘苷

黄 莉，夏新华，谭喜平

(湖南中医药大学药学院，湖南长沙 410208)

荆防小儿止咳口服液由荆芥、防风、连翘、苦杏仁等12味中药组方制备而成，具有清热解表、止咳化痰的功效，临床上主要用于治疗小儿急性支气管炎和小儿慢性支气管炎的急性发作。防风为伞形科植物防风 Saposhnikovia divaricate(Turcz.)Schischk的干燥根［1］，色原酮类化合物升麻素苷作为防风中的主要化学成分，具有明显的解热镇痛、抗炎免疫作用［2-3］，由于其水溶性低，在以水为主要溶剂而提取的口服液制剂制备过程中转移率自然不高［4］，故选择灵敏度好、稳定性高的测定方法是十分必要的。连翘为木犀科植物连翘Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl的干燥果实［1］，其特征性有效成分为木脂素类物质连翘苷，连翘苷具有抗炎解热、解毒抗氧化等作用［5-6］，。鉴于连翘苷和升麻素苷均为荆防小儿止咳口服液的药效物质基础，为控制该制剂的质量，所建立的SPE-HPLC分析方法能够明显地减少杂质干扰，具有快速、简便，良好的准确度和重复性等优点，对荆防小儿止咳口服液的质量控制有重要的指导意义。

1 仪器与试药

1.1 仪器 大连依利特液相色谱仪，配备P1201色谱泵、UV1201紫外检测器、EC2006色谱工作站;RE-52A旋转蒸发仪 (上海亚荣生化仪器有限公司);电子分析天平 (AY120 shimadzu 0.1 mg～120 mg);超声清洗仪 (HS3120，3 L);电动离心机 (80-1型，4000 r/min，金坛市城西晓阳电子仪器厂);玻璃层析柱 (长40 cm，内径1 cm)。

1.2 试药 升麻素苷 (批号111522-201209，中国食品药品检定研究院);连翘苷 (批号110821-200610，中国药品生物制品检定所);中性氧化铝(100～200目、200～300目，FCP)、酸性氧化铝(100～200目，FCP)、碱性氧化铝 (100～200目，FCP)(国药集团化学试剂有限公司);荆防小儿止咳口服液 (由本实验室提供，批号20130815)，乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Kromasil ODS1色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱 (0～15 min，16%乙腈;15～50 min，22%乙腈)，体积流量1.0 mL/min，检测波长277 nm，柱温30℃，进样量10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品贮备液的制备 精密称取升麻素苷对照品 (于P2O5干燥器中干燥24 h)11.7 mg，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得升麻素苷贮备液 (0.234 mg/mL)。精密称取连翘苷对照品 (于P2O5干燥器中干燥24 h)13.8 mg，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得连翘苷贮备液 (0.276 mg/mL)。

2.2.2 混合对照品溶液的制备 分别精密吸取升麻素苷、连翘苷对照品贮备液适量，同置于5 mL量瓶中，用甲醇稀释成升麻素苷0.0468 mg/mL、连翘苷0.0552 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备

2.2.3.1 甲醇法 精密量取口服液4 mL，加一定量的甲醇超声30 min，置于10 mL离心管中定容并离心10 min(4000 r/min)取上清液于0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得［7-8］。

2.2.3.2 正丁醇萃取法 精密量取口服液4 mL，用水饱和的正丁醇液萃取4次 (10 mL/次)，合并正丁醇液，于水浴蒸干，残渣加甲醇定容至10 mL，超声10 min，摇匀，于0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得［9］。

2.2.3.3 SPE萃取法 精密量取口服液4 mL，水浴蒸至近干，加中性氧化铝2 g拌匀，加于中性氧化铝柱 (100～200目，6 g，干法装柱)的顶端，用50%乙醇40 mL洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至干，残渣用甲醇溶解，超声10 min并定容至10 mL，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得［10］。

2.2.4 阴性溶液的制备 按处方比例依据药材提取工艺分别制备不含连翘和防风及两者均不含的阴性样品药液，按“2.2.3.3”项下方法制备，即得。

2.3 专属性试验 精密吸取混合对照品、供试品、阴性对照和双阴性对照溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。在此条件下，升麻素苷和连翘苷的色谱峰型好，与其他组分基线分离，分离度均大于1.5，理论塔板数按连翘苷计算大于3500，按升麻素苷计算在1000以上，且阴性样品对升麻素苷、连翘苷的测定无干扰。见图1。

2.4 供试品溶液制备中氧化铝固相萃取条件的考察

图1 专属性的HPLC图谱Fig.1 Specific chromatographs of HPLC

2.4.1 氧化铝种类的考察 分别称取中性、酸性和碱性氧化铝4 g，各3份，干法装柱 (玻璃层析柱长40 cm，内径1 cm)，精密吸取样品4 mL，蒸至近干，加入相应种类的氧化铝2 g拌匀，加于氧化铝柱顶端，用80 mL的70%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压蒸干，残渣加甲醇溶解并超声10 min后定容至10 mL，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，按“2.1”项下的色谱条件测定升麻素苷和连翘苷的量。结果表明，3种不同类型的氧化铝对样品中升麻素苷和连翘苷的影响相近，考虑中性氧化铝所处理的样品分离效果和重复性好，而酸性和碱性氧化铝处理的样品测定结果误差较大，故选择中性氧化铝作为固相萃取的固定相 (见表1)。

表1 不同性质氧化铝的影响 (n=3)Tab.1 Effect of Al2O3with different natures(n=3)

2.4.2 中性氧化铝粒径大小的考察 分别称取两种不同粒径的中性氧化铝 6 g，各 3份，按“2.4.1”项下方法进行。结果表明，样品中升麻素苷和连翘苷的测得量受中性氧化铝粒径大小的影响较大，经100～200目中性氧化铝层析后所测得的升麻素苷和连翘苷的量较高，且重复性好。因此，中性氧化铝的粒径越小，对升麻素苷和连翘苷的吸附作用越强，能被洗脱剂洗脱出的量越低，故选用100～200目的中性氧化铝作为固相萃取的固定相 (见表2)。

表2 不同粒径中性氧化铝的比较 (n=3)Tab.2 Comparison of neutral Al2O3with different particle sizes(n=3)

2.4.3 中性氧化铝的活度考察 将部分层析用100～200目的中性氧化铝于110℃真空干燥5 h提高活度，分别称取活化和未活化的100～200目的中性氧化铝6 g，各3份，以下操作按“2.4.1”项下方法进行。结果表明，中性氧化铝活化与否对升麻素苷和连翘苷的测得量并没有明显的影响，但活化后的中性氧化铝有明显改善升麻素苷和连翘苷的基线分离效果，有利于提高样品分析的重复性。

2.4.4 氧化铝用量的考察

2.4.4.1 装柱氧化铝用量 分别称取100～200目的中性氧化铝各2、4、6、8 g，填装至玻璃层析柱(柱长40 cm，内径 1 cm)中，精密吸取样品4 mL，各4份，按“2.4.1”项下方法进行。结果表明，装柱氧化铝用量不同，对被测物质的吸附和保留效果存在不同影响，尤其是对连翘苷的测定有很大的影响。当中性氧化铝的装柱用量为6 g时，升麻素苷和连翘苷的测得量均为最大值，故确定装柱中性氧化铝用量为6 g(见图2)。

图2 装柱氧化铝用量的影响Fig.2 Influence of dosage of Al2O3in the column

2.4.4.2 上样氧化铝用量 称取100～200目中性氧化铝6 g，共4份，分别装入4根玻璃柱 (柱长40 cm，内径1 cm)中，精密吸取样品4 mL，共4份，蒸至近干，分别加入1、2、3、4 g中性氧化铝 (100～200目)拌匀，以下操作按“2.4.1”项下方法进行。结果表明，不同用量的氧化铝拌样，测得的升麻素苷和连翘苷量存在一定的差异。当采用2 g中性氧化铝拌样时，对两者测得量的影响均最大，故确定上样中性氧化铝用量为2 g(见图3)。

图3 上样氧化铝用量对测得量的影响Fig.3 Effect of different loading dosages of Al2O3 to content

2.4.5 洗脱剂乙醇的考察 称取100～200目中性氧化铝6 g，共4份，分别装入4根玻璃柱 (柱长40 cm，内径1 cm)中，精密吸取样品4 mL，共4份，蒸至近干，加入相应中性氧化铝2 g拌匀，加于氧化铝柱顶端进行干法上样，然后分别用30%、50%、70%和90%乙醇各80 mL洗脱氧化铝柱，分别收集洗脱液，按“2.4.1”项下方法进行。结果表明，50%乙醇和70%乙醇洗脱所得样品中升麻素苷和连翘苷的量均高于90%乙醇洗脱所得样品，而30%乙醇洗脱所得样品的色谱图中杂质峰较多 (见图4)。因此，从节约溶剂的角度，选择50%乙醇作为洗脱剂为宜。

图4 不同体积分数乙醇的影响Fig.4 Effect of different ethanol contents in the eluent

2.4.6 洗脱剂用量的考察 称取100～200目中性氧化铝6 g，同上干法装柱，精密吸取样品4 mL，蒸至近干，同上进行拌样和上样，用50%乙醇洗脱氧化铝柱，以每份20 mL收集洗脱液，冲洗至洗脱液中无法检测到升麻素苷和连翘苷为止，以下操作按“2.4.1”项下方法进行。结果表明，当洗脱液收集到第2份时，连翘苷已基本洗脱完全，故确定洗脱时50%乙醇的用量为40 mL(见图5)。

图5 洗脱剂用量的影响Fig.5 Effect of the eluent volume

2.5 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液2、5、8、10、12、15 μL，分别注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定升麻素苷和连翘苷的峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。升麻素苷和连翘苷的标准曲线分别得回归方程Y=46.823X－2.8277(r=0.9998)、Y=37.018X－14.574(r=0.9996)，结果表明升麻素苷和连翘苷分别在0.0936～0.7020 μg、0.1104～0.8280 μg范围内线性关系良好。

2.6 精密度试验 精密吸取同一混合对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，重复进样6次，记录色谱图峰面积，结果测得升麻素苷和连翘苷的RSD分别为1.02%和0.54%，说明仪器的精密度良好。

2.7 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液各10 μL，于0、2、4、8、12、24 h时注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进行测定，测得的升麻素苷和连翘苷的RSD分别为1.50%和2.62%(n=6)，结果表明供试品在24 h内基本稳定。

2.8 重复性试验 精密吸取同一批号的荆防小儿止咳口服液，按“2.2.3.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件分别进样，结果升麻素苷和连翘苷的RSD分别为2.38%和1.10%，表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验 精密吸取同一批号的荆防小儿止咳口服液，共6份，每份2 mL(升麻素苷和连翘苷分别为0.1047 mg/mL、0.2012 mg/mL)，分别加入升麻素苷对照品溶液 (0.234 mg/mL)0.9 mL、连翘苷对照品溶液 (0.276 mg/mL)1.45 mL，按“2.2.3.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定并计算，结果见表3。

表3 加样回收率试验结果 (n=6)Tab.3 Results of recovery tests(n=6)

3 讨论

3.1 检测波长的选择 文献 ［11］表明，连翘苷在205 nm波长处最为灵敏，但由于在低波长处杂质峰干扰较大，故参考《中国药典》2010年版对升麻素苷和连翘苷进行HPLC测定的检测波长，分别在254 nm和277 nm测定了混合对照品的HPLC色谱图，以扩大两者的定量范围。结果表明，当波长为277 nm时，升麻素苷和连翘苷的色谱峰响应灵敏且峰型对称，其灵敏度明显高于254 nm，故选择277 nm作为同时定量分析两种成分的检测波长。

3.2 色谱条件的优选 曾以不同比例的甲醇-水、甲醇-乙腈-水［12］、甲醇-0.05%磷酸水［13］、乙腈-水等作为流动相，考察HPLC色谱峰的分离效果。结果表明，以甲醇-水组成流动相系统，由于甲醇洗脱能力低于乙腈，会大大延长样品分析时间，且升麻素苷和连翘苷的峰型较差。而以乙腈-水组成流动相系统，升麻素苷、连翘苷与其他杂质峰分离良好，阴性无干扰，分析时间适宜。另外，连翘苷为木脂素类成分，其极性较弱，故在分析连翘苷时，增大梯度洗脱系统中乙腈的比例，以缩短样品的分析时间。

3.3 样品处理方法的优化 在供试品溶液制备方法考察中，曾采用甲醇法、正丁醇萃取法处理样品，由于本口服液为中药复方制剂，化学成分复杂，且含糖量大，导致两个主要化学成分的液相色谱图存在很多杂质峰，文献 ［14-15］表明，氧化铝固相萃取应用于样品的前处理时，有利于纯化待测物质和减少杂质干扰，便于实现快速定量分析。升麻素苷和连翘苷的结构不被Al3+所络合，可洗脱，能去除糖、黄酮类等成分的干扰。故在参照药典条件的基础上采用氧化铝对口服液进行固相萃取，并确保了升麻素苷和连翘苷色谱峰的良好分离效果。

3.4 氧化铝柱层析条件分析 通过对氧化铝柱层析条件的考察，确定了氧化铝固相萃取的最佳条件:用中性氧化铝6 g(100～200目)干法装柱，并用中性氧化铝2 g干法拌样，洗脱剂为50%乙醇，洗脱体积为40 mL。采用中性氧化铝固相萃取法处理样品，能高度纯化升麻素苷和连翘苷，避免其他杂质的干扰，结合高效液相色谱法测定两者的含量，可以为该制剂建立简便、快速和准确的定量分析方法。

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