HPLC法测定复方香薷水中麝香草酚、香荆芥酚、木香烃内酯、去氢木香内酯和迷迭香酸

谢 婷

(常州工程职业技术学院，江苏常州 213000)

复方香薷水为中药复方制剂，处方源于卫生部药品标准中药成方制剂第二十册，由皱叶香薷、木香、紫苏叶、歪叶蓝、广藿香、厚朴、豆蔻、生姜、甘草等九味药物组成。具有解表化湿、醒脾和胃之功效、可用于外感风寒、内伤暑湿、寒热头痛、脘腹痞满胀痛、恶心欲吐、肠鸣腹泻等症的治疗［1-2］。原质量标准仅对方中木香和厚朴进行了显微鉴别控制，未对方中的任何药味进行成分定量测定。皱叶香薷、木香和紫苏叶为方中主要药物，皱叶香薷具有发汗解表、化湿和中的功效，可用于暑湿感冒、恶寒发热、头痛无汗、腹痛吐泻、水肿、小便不利等症的治疗;木香具有行气止痛、健脾消食的功效，可用于胸胁、脘腹胀痛、泻痢后重、食积不消、不思饮食等症的治疗;紫苏叶具有解表散寒、行气和胃的功效，可用于风寒感冒、咳嗽呕恶、妊娠呕吐、鱼鳖中毒等症的治疗。同时麝香草酚和香荆芥酚为皱叶香薷主要成分，木香烃内酯和去氢木香内酯为木香主要成分，迷迭香酸为紫苏叶主要成分。为保证产品质量，确保临床疗效，本实验采用高效液相色谱法对皱叶香薷中麝香草酚、香荆芥酚和木香中木香烃内酯、去氢木香内酯以及紫苏叶中的迷迭香酸进行定量测定方法研究，为完善该制剂质量标准提供依据。

1 材料

高效液相色谱仪 (日本岛津LC-10ATVP型，岛津自动进样器SIL-10ADVP);ANASTAR色谱数据工作站;紫外可见检测器 (SPD-1OAVP);麝香草酚 (批号 100508-200902)、香荆芥酚 (批号111691-200602)、木香烃内酯 (批号 111524-201107)、去氢木香内酯 (批号111525-201008)和迷迭香酸 (批号111871-201102)对照品均购于中国食品药品检定研究院;复方香薷水 (每瓶装10 mL;批号为130407，130415，130423)购于广州一品红制药有限公司;甲醇、乙腈 (色谱纯，安徽时联特种溶剂股份有限公司);冰乙酸 (色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司);磷酸 (分析纯，廊坊鹏彩精细化工有限公司)。

2 方法与结果

2.1 麝香草酚和香荆芥酚的定量分析［3-12］

2.1.1 色谱条件及系统适应性 Hypersil C18色谱柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相为乙腈-2%冰醋酸溶液 (65∶35)，检测波长275 nm;体积流量为1.0 mL/min。在此条件下麝香草酚和香荆芥酚与其他组分分离效果良好，以麝香草酚计理论塔板数应不低于3000。

2.1.2 检测波长的选择 分别取麝香草酚对照品和香荆芥酚对照品适量，加65%甲醇溶解制成每1 mL含0.05 mg的溶液，在200～400 nm波长处进行紫外扫描，结果麝香草酚对照品和香荆芥酚对照品均在275 nm处有最大吸收，故将检测波长定为275 nm。

2.1.3 对照品混合溶液的制备 精密称取麝香草酚对照品和香荆芥酚对照品各适量，加65%甲醇制成对照品混合溶液 (麝香草酚为0.0358 mg/mL，香荆芥酚为0.0712 mg/mL)。

2.1.4 供试品溶液的配制 取本品适量，精密量取2 mL，置50 mL量瓶中，加65%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.1.5 阴性对照溶液的配制 按复方香薷水处方比例称取适量除皱叶香薷的其余药味，按复方香薷水的前处理和制剂生产工艺制成缺皱叶香薷的阴性样品，按照上述供试品溶液的配制方法制成缺皱叶香薷的阴性对照溶液。

2.1.6 线性关系考察 精密吸取对照品混合溶液1、5、10、15、20 μL，按上述色谱条件进行测定，以峰面积积分值为纵坐标，麝香草酚、香荆芥酚量为横坐标分别绘制标准曲线，得回归方程。麝香草酚Y=4.0246×106X－864.2，r=0.9994;香荆芥酚Y=5.6472×106X+1022.4，r=0.9992。结果表明麝香草酚在0.0358～0.716 μg范围内进样量与峰面积线性关系良好;香荆芥酚在0.0712～1.424 μg范围内进样量与峰面积线性关系良好。

2.1.7 阴性对照试验 分别精密吸取10 μL的供试品溶液、对照品溶液及阴性对照溶液，按“2.1.1”项的色谱条件进行色谱分析，结果供试品溶液色谱中，在与麝香草酚对照品和香荆芥酚对照品相同保留时间处有吸收峰，而阴性对照溶液在相同保留时间处未显吸收峰，见图1。

2.1.8 精密度试验 取对照品混合溶液重复进样6次，按“2.1.1”项的色谱条件测定麝香草酚和香荆芥酚的峰面积，结果表明，仪器具有良好的精密度，麝香草酚和香荆芥酚的RSD分别为0.57%、0.93%。

图1 麝香草酚和香荆芥酚的HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatograms of thymol and carvacrol

2.1.9 重复性试验 取同一批样品，按上述方法制备6份供试品溶液，分别测定，麝香草酚和香荆芥酚的RSD分别为0.64%、0.88%。结果表明本方法具有良好的重复性。

2.1.10 稳定性试验 取同一供试品溶液，在放置0、1、2、4、6、8 h后精密吸取10 μL进样，测定其峰面积值，麝香草酚和香荆芥酚的RSD分别为0.59%、0.47%，供试品溶液8 h内基本稳定。

2.1.11 加样回收率试验 取已知含有量 (麝香草酚0.91 mg/mL、香荆芥酚1.70 mg/mL)的同一批样品适量，精密量取1 mL，置50 mL量瓶中，分别精密加入对照品混合溶液25 mL，加65%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为加样供试液。精密吸取加样供试液10 μL，按上述测定方法测定其峰面积，计算回收率，结果表明本方法回收率良好，见表1。

表1 麝香草酚和香荆芥酚回收率试验结果Tab.1 Results of recovery tests for thymol and carvacrol

2.2 木香烃内酯和去氢木香内酯的定量分析［13-21］2.2.1 色谱条件及系统适应性 Hypersil C18色谱柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相A为乙腈，流动相B为0.4%磷酸溶液，梯度洗脱 (0～26 min，35.0%A;26～39 min，35.0%→52.0%A;39～55 min，52.0%A);体积流量1.0 mL/min，检测波长227 nm。在此条件下木香烃内酯和去氢木香内酯与其他组分基线分离良好，以木香烃内酯计理论塔板数应不低于3000。

2.2.2 检测波长的选择 分别取木香烃内酯和去氢木香内酯对照品适量，加流动相溶解制成每1 mL含0.10 mg的溶液，按紫外-可见分光光度法在200～400 nm波长处进行紫外扫描，结果木香烃内酯和去氢木香内酯对照品均在227 nm处有最大吸收，故检测波长定为227 nm。

2.2.3 对照品混合溶液的制备 精密称取木香烃内酯和去氢木香内酯对照品适量，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解后稀释至刻度，摇匀，即得对照品混合溶液 (木香烃内酯为0.0322 mg/mL和去氢木香内酯0.0752 mg/mL)。

2.2.4 供试品溶液的制备 取本品适量，精密量取2 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.5 阴性对照溶液的制备 按复方香薷水处方比例称取适量除木香的其余药味，按复方香薷水的前处理和制剂生产工艺制成缺木香的阴性样品，按照上述供试品溶液的配制方法制成缺木香的阴性对照溶液。

2.2.6 线性关系考察 分别精密吸取对照品混合溶液1、5、10、15、20 μL，按 “2.2.1”项下的色谱条件进行梯度洗脱，以峰面积积分值为纵坐标，木香烃内酯、去氢木香内酯量为横坐标分别绘制标准曲线，木香烃内酯回归方程为Y=2.5384×106X－614.1，r=0.9995;去氢木香内酯为Y=4.1267×106X+862.6，r=0.9993。结果表明木香烃内酯在0.0322～0.6440 μg范围内进样量与峰面积线性关系良好;去氢木香内酯在0.0752～1.5040 μg范围内进样量与峰面积线性关系良好。

2.2.7 阴性对照试验 分别精密吸取10 μL的供试品溶液、对照品溶液及阴性对照溶液，按“2.2.1”项的色谱条件进行色谱分析，结果供试品溶液色谱中，在与木香烃内酯和去氢木香内酯对照品相同保留时间处有吸收峰，而阴性对照溶液在相同保留时间处未显吸收峰，见图2。

图2 木香烃内酯和去氢木香内酯的HPLC图谱Fig.2 HPLC chromatograms of costunolide and dehydrocostuslactone

2.2.8 稳定性试验 取同一供试品溶液，在放置0、1、2、4、6、8 h后精密吸取10 μL进样，测定其峰面积值，RSD分别为0.77%(木香烃内酯)、0.38%(去氢木香内酯)。结果表明，供试品溶液8 h内基本稳定。

2.2.9 精密度试验 取对照品混合溶液重复进样6次，按“2.2.1”项的色谱条件测定木香烃内酯和去氢木香内酯的峰面积，结果表明，仪器具有良好的精密度，RSD分别为0.61%(木香烃内酯)、0.92%(去氢木香内酯)。

2.2.10 重复性试验 取同一批样品，按上述方法制备6份供试品溶液，分别测定，RSD分别为0.64%(木香烃内酯)、0.81%(去氢木香内酯)。结果表明本方法具有良好的重复性。

2.2.11 加样回收率试验 取已知含有量 (木香烃内酯0.82 mg/mL、去氢木香内酯1.96 mg/mL)的同一批样品适量，精密量取1 mL，置50 mL量瓶中，分别精密加入对照品混合溶液25 mL，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为加样供试液。精密吸取加样供试液10 μL，按上述测定方法测定其峰面积，计算回收率，结果表明本方法回收率良好，见表2。

表2 木香烃内酯和去氢木香内酯回收率试验结果Tab.2 Results of recovery tests for costunolide and dehydrocostuslactone

2.3 迷迭香酸的测定［22-24］

2.3.1 色谱条件及系统适应性 Hypersil C18色谱柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);甲醇-0.5%磷酸水溶液 (35∶65)为流动相，检测波长330 nm，体积流量为1.0 mL/min。在此条件下迷迭香酸与其他组分分离效果良好，以迷迭香酸计理论塔板数应不低于3000。

2.3.2 检测波长的选择 取迷迭香酸对照品适量，加流动相溶解制成每1 mL含0.05 mg的溶液，在200～400 nm波长处进行紫外扫描，结果迷迭香酸对照品在331 nm处有最大吸收，参考《中国药典》2010年版一部紫苏子药材含量测定项下检测波长为330 nm，故将检测波长定为330 nm。

2.3.3 对照品溶液的制备 精密称取迷迭香酸对照品适量，加甲醇制成含迷迭香酸0.0486 mg/mL的对照品溶液。

2.3.4 供试品溶液的配制 取本品适量，精密量取2 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.3.5 阴性对照溶液的配制 按复方香薷水处方比例称取适量除紫苏叶的其余药味，按复方香薷水的前处理和制剂生产工艺制成缺紫苏叶的阴性样品，按照上述供试品溶液的配制方法制成缺紫苏叶的阴性对照溶液。

2.3.6 线性关系考察 精密吸取对照品溶液1、5、10、15、20 μL，按上述色谱条件进行测定，以峰面积积分值为纵坐标，迷迭香酸量为横坐标分别绘制标准曲线，得回归方程Y=3.2457×106X－651.4，r=0.9994。结果表明迷迭香酸在0.0486～0.9720 μg进样量与峰面积线性关系良好。

2.3.7 阴性对照试验 分别精密吸取10 μL的供试品溶液、对照品溶液及阴性对照溶液，按“2.3.1”项的色谱条件进行色谱分析，结果供试品溶液色谱中，在与迷迭香酸对照品相同保留时间处有吸收峰，而阴性对照溶液在相同保留时间处未显吸收峰，见图3。

2.3.8 精密度试验 取对照品溶液重复进样6次，按“2.3.1”项的色谱条件测定迷迭香酸的峰面积，结果表明，仪器具有良好的精密度，迷迭香酸RSD为0.67%。

2.3.9 重复性试验 取同一批样品，按上述方法制备6份供试品溶液，分别测定，迷迭香酸RSD为0.81%。结果表明本方法具有良好的重复性。

2.3.10 稳定性试验 取同一供试品溶液，在放置0、1、2、4、6、8 h后精密吸取10 μL进样，测定其峰面积值，迷迭香酸RSD为0.89%，供试品溶液8 h内基本稳定。

2.3.11 加样回收率试验 取已知含有量 (迷迭香酸1.23 mg/mL)的同一批样品适量，精密量取1 mL，置50 mL量瓶中，分别精密加入对照品溶液25 mL，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为加样供试液。精密吸取加样供试液10 μL，按上述方法测定其峰面积，计算回收率，结果表明本方法回收率良好，结果见表3。

图3 迷迭香酸的HPLC图谱Fig.3 HPLC chromatograms of rosmarinic acid

表3 迷迭香酸回收率试验结果Tab.3 Results of recovery test for rosmarinic acid

2.4 样品测定 取3批样品按“2.1”项下麝香草酚和香荆芥酚测定方法、“2.2”项下木香烃内酯和去氢木香内酯测定方法和“2.3”项下迷迭香酸测定方法测定，结果见表4。

3 讨论

麝香草酚和香荆芥酚测定时分别以甲醇-0.5磷酸溶液 (85∶15)、甲醇-2%冰醋酸溶液 (60∶40)和乙腈-2%冰醋酸溶液 (65∶35)为流动相，结果甲醇－0.5磷酸溶液 (85∶15)分离效果不好，未达到基线分离;甲醇-2%冰醋酸溶液(60∶40)麝香草酚与其他色谱峰能达到基线分离但香荆芥酚与其他色谱峰不能达到基线分离。而乙腈-2%冰醋酸溶液 (65∶35)麝香草酚和香荆芥酚与其他色谱峰均能达到基线分离。故选用乙腈-2%冰醋酸溶液 (65∶35)为流动相。

表4 样品测定结果Tab.4 Results of content determination

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:57-58，242-243，318-319，附录30，附录36.

［2］国家药典委员会.国家药品标准中药成方制剂:第二十册［S］.北京:人民卫生出版社，1998:210.

［3］陈 丹，李 柯，胡薏冰，等.高效液相色谱法测定显脉旋覆花药材中麝香草酚和异丁酸百里香酯的含量［J］.中国民族民间医药，2012，21(21):45-46，48.

［4］刘亚妮，魏柳珍，于捷飞，等.气相色谱法同时测定无极膏中5个挥发性有效成分的含量［J］.药物分析杂志，2012，32(3):406-409.

［5］黄家卫，盛振华，张 蓓，等.HPLC法测定银黄喷雾剂中麝香草酚及荆芥酚的含量［J］.中华中医药杂志，2011，26(11):2693-2695.

［6］陈 欣，陈 鹏.RP-HPLC测定麝香草酚的含量及有关物质［J］.华西药学杂志，2012，27(1):102-103.

［7］陈 哲，徐万帮.直接滴定法测定麝香草酚原料的含量［J］.北方药学，2011，8(1):12-13.

［8］傅应华.气相色谱法同时测定复方麝香草酚搽剂中麝香草酚和樟脑含量［J］.中成药，2009，31(3):486-487.

［9］韩 亮，冯毅凡，李卫民，等.气相色谱法测定暑湿感冒灵中麝香草酚和香荆芥酚的含量［J］.中成药，2007，29(5):690-693.

［10］邓 燕，王西芳.百里香的质量标准研究［J］.现代中医药，2011，31(3):58-60.

［11］孙丽娟，刘红兵，许汉林，等.湖北产牛至药材中香荆芥酚和麝香草酚的含量测定［J］.中药材，2005，28(7):562-563.

［12］廖 芳，杨振德，黄庆华，等.麝香草酚和香荆芥酚对痢疾杆菌和肠炎常见菌的体外抗菌效应［J］.医药导报，2005，24(10):868-870.

［13］张 丽，陈 菊，孙桂琳，等.HPLC测定维药金锁昆都尔片中木香含量［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19(2):123-125.

［14］周广涛，高 鹏，戴 兵，等.木香中去氢木香内酯和木香烃内酯提取工艺优化［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19(2):10-42.

［15］刘正清.不同产地和采收时间木香药材中木香烃内酯和去氢木香内酯的测定［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18(16):116-118.

［16］吴趋凡，高 明，李 耿.姜香安胃软胶囊质量标准研究［J］.南京中医药大学学报，2013，29(1):75-77.

［17］谢友良，刘常青，童玉林，等.HPLC法同时测定香连片中两种内酯［J］.中成药，2012，34(8):1515-1518.

［18］倪 琳，杨 锡.HPLC法同时测定达斯玛保丸中木香烃内酯、异土木香内酯和土木香内酯［J］.中成药，2012，34(4):664-666.

［19］魏 华，彭 勇，马国需，等.木香有效成分及药理作用研究进展［J］.中草药，2012，43(3):613-620.

［20］黄 澜，黄 丽.RP-HPLC法同时测定保济丸中厚朴酚、和厚朴酚、木香烃内酯及去氢木香内酯的含量［J］.药物分析杂志，2012，32(3):396-399.

［21］张 旭，侯 影，贾天柱.正交法配合药效指标综合筛选木香切制工艺［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17(7):9-12.

［22］谷丽华，林 晨，吴 弢，等.紫苏子药材质量标准研究［J］.中国中药杂志，2010，35(16):2087-2090.

［23］黄亮辉，苏 琪，赵婷婷，等.白苏子和紫苏子生品及其炮制品中迷迭香酸的含量测定［J］.中药材，2010，33(12):1856-1858.

［24］黄亮辉，赵英永，王李丽，等.高速逆流色谱分离纯化紫苏叶中迷迭香酸［J］.药物分析杂志，2011，31(11):2087-2090.