HPLC法同时测定妇炎净片中4种成分

崔 玲，何云飞，徐灿辉

(1.益阳市中医院，湖南益阳 413000;2.南华大学，湖南衡阳 421001)

妇炎净片是由苦玄参、地胆草、当归、两面针、五指毛桃等九味中药材组成的的复方制剂，具有清热祛湿、行气止痛的功效。其质量标准为“国家食品药品管理局标准YBZ09362006-2009Z”，采用高效液相色谱法测定阿魏酸的量，未将君药苦玄参的化学成分测定列入其中，为此，郭艳霞等［1］建立了高效液相色谱法测定苦玄参苷IA，妇炎净其他剂型的苦玄参苷IA定量测定方法也有报道［2］。五指毛桃在处方中用量最大，具有健脾利湿、益肺止咳、舒筋通络功效［3-4］，香豆素类成分补骨脂素和异补骨脂素是其主要功效性成分之一［5-6］，将其作为评价五指毛桃质量的依据已被广泛采用［7-8］，但是在妇炎净片中的定量测定研究目前未见报道。为了全面控制产品质量并简化定量测定方法，本实验以苦玄参苷IA、阿魏酸、补骨脂素和异补骨脂素作为指标性成分，采用高效液相色谱梯度洗脱法对4种成分同时定量测定，以控制方中苦玄参、当归和五指毛桃的质量。

1 仪器与试药

岛津LC-20AT高效液相色谱仪 (DAD检测器)LC solution工作站，GB204电子分析天平 (梅特勒-托利多仪器有限公司)，CG-300超声仪 (张家港市港威超声电子有限公司)。苦玄参苷 IA对照品(111745-200501)，阿魏酸对照品 (110773-201313)，补骨脂素对照品 (110739-201115)，异补骨脂素对照品 (110738-201012)均购自中国食品药品检定研究院。妇炎净片购自海南葫芦娃制药有限公司 (批号130407，0.5 g/片)、江西药都仁和制药有限公司(批号130115，0.4 g/片)、秦皇岛皇威制药股份有限公司 (批号130605，0.4 g/片)。乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯。水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Kromasil C18色谱柱 (5 μm，4.6 mm×250 mm)(天津菲罗门科技有限公司生产);1%冰乙酸为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱 (0～15 min，85%A;15～20 min，85%A→63%A;20 ～35 min，63%A;35 ～40 min，63%A→85%A;40～45 min，85%A);体积流量1.0 mL/min;检测波长245 nm;柱温30℃;进样量 10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 混合对照品溶液 分别取苦玄参苷IA、阿魏酸、补骨脂素和异补骨脂素对照品，精密称定，用甲醇溶解并定量稀释制成质量浓度分别为750、125、50、60 μg/mL的溶液，作为对照品贮备溶液。各精密量取上述4种对照品的贮备溶液适量(0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL)，置同一25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成系列质量浓度的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取本品20片，除去包衣，精密称定，研细，取约5片量，精密称定，置50 mL量瓶中，加入甲醇适量，超声处理30 min，放冷，加甲醇稀释至刻度，过滤，精密量取续滤液25 mL，置蒸发皿中，蒸干，用甲醇溶解转移至10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为供试品溶液。

2.2.3 阴性对照样品溶液 按处方量和制备工艺分别制备缺苦参的样品、缺当归的样品、缺五指毛桃的样品和同时缺苦玄参、当归和五指毛桃的样品，同供试品溶液制备方法制备阴性对照样品溶液。

2.3 专属性 取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液分别注入色谱仪，记录色谱图。由图1可见，阴性样品溶液不干扰测定。

图1 高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

2.4 线性 取“2.2.1”项配制的系列质量浓度混合对照品溶液，照上述色谱条件试验，记录色谱图，以峰面积 (Y)对质量浓度 (X)进行线性回归，得到4种分析物的回归方程、相关系数，结果见表1。

表1 4种成分的线性范围及回归方程Tab.1 Regression equations，linear ranges，correlation coefficients of four constituents

2.5 精密度试验 取混合对照品溶液连续进样6次，记录色谱图，苦玄参苷IA、阿魏酸、补骨脂素和异补骨脂素峰面积平均值的相对标准偏差(RSD)分 别 为 0.41%、0.63%、0.59%、0.44%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取样品 (批号130115)按“2.2.2”项制成供试品溶液，共6份，记录色谱图，将峰面积代入“2.4”项线性回归方程计算各成分量。每片含苦玄参苷IA、阿魏酸、补骨脂素和异补骨脂素的平均值分别为233、41、15、18 μg，相对标准偏差 (RSD)分别为 0.58%、0.68%、0.77%、0.85%，表明本法有较好的重复性。

2.7 稳定性试验 取样品 (批号130115)按“2.2.2”项制成的供试品溶液，每隔2 h进样1次，共6次，记录色谱图，苦玄参苷IA、阿魏酸、补骨脂素和异补骨脂素峰面积平均值的相对标准偏差 (RSD)分别为 1.38%、1.05%、1.26%、0.88%，表明样品溶液在12 h内稳定。

2.8 加样回收率试验 取已测定样品 (批号130115)约2.5片，精密称定，共9份，分别按样品中所含各成分的80%、100%和120%计算，加入4种对照品的贮备溶液，按供试品溶液制备方法处理，按上述色谱条件测定，将峰面积代入“2.4”项线性回归方程计算各成分量，计算回收率。结果见表2。

表2 回收率试验结果 (n=9)Tab.2 Results of recovery tests(n=9)

2.9 样品测定 取3个不同生产厂家不同批号的样品，按照“2.2.2”项进行处理，每批平行处理5份，按上述色谱条件测定，将峰面积代入“2.4”项下线性回归方程计算，结果见表3。

表3 妇炎净片中4种成分的测定结果 (n=5)Tab.3 Determination of four constituents in Fuyanjing Tablets(n=5)

3 讨论

由于4种成分的极性差别较大，同时测定时采用梯度洗脱才能有效分离。根据各成分的理化性质和色谱行为，分别采用了以甲醇与水、乙腈与纯水、1%冰乙酸溶液与乙腈构成的洗脱系统。结果表明，以甲醇与水为系统基线的波动较大，各成分的分离效果不理想，乙腈-纯水系统色谱峰拖尾明显，1%冰乙酸溶液与乙腈系统各成分的色谱峰峰型对称，理论塔板数高，分离度好。

通过调取DAD检测的紫外光谱可知苦玄参苷IA、阿魏酸、补骨脂素和异补骨脂素的最大吸收波长分别为264、316、245、246 nm，与相关文献一致［9-12］，由于苦玄参苷IA、阿魏酸在245 nm附近均有较强吸收，补骨脂素和异补骨脂素的最大吸收波长相近，补骨脂素在4种成分中含有量最低，因此，选择补骨脂素的最大吸收波长作为检测波长，均能满足定量测定的要求。

实验分别用乙醇、70%甲醇和甲醇作为溶剂对样品分别进行冷浸，回流和超声提取，结果表明甲醇超声提取完全且杂质干扰峰较少。对超声处理15、20、25、30、35 min进行考察，结果表明超声处理25 min后各成分量不再增加，考虑到样品的差异性，选择超声处理30 min。

本实验采用高效液相色谱法梯度洗脱，能快速、准确地同时测定妇炎净片中苦玄参苷IA、阿魏酸、补骨脂素和异补骨脂素的量，可作为妇炎净片质量标准改进的参考。

［1］郭艳霞，刘 敬，陈道蓉，等.HPLC法测定妇炎净片中苦玄参苷IA的含量［J］.成都中医药大学学报，2008，31(3):54-56.

［2］唐秀玲，吕轶峰.HPLC法测定妇炎净胶囊中苦玄参苷IA的含量［J］.中国药师，2011，14(3):429-430.

［3］现代中药学大词典编委会.现代中药学大词典［M］.北京:人民卫生出版社，2001:371.

［4］王伟伟，陈 瑶.五指毛桃的化学成分和药理作用研究进展［J］.中国民族民间医药，2013，41(2):41-42.

［5］林 慧，梅全喜，曾聪彦.五指毛桃化学成分及其药理活性研究概况［J］.今日药学，2012，22(8):484-486.

［6］林 励，钟小清，魏 刚.五指毛桃挥发性成分的GC-MS分析［J］.中药材，2000，23(4):206-207.

［7］王晓平，黄 翔，陆奇丰，等.HPLC测定不同叶型五指毛桃中补骨脂素的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19(5):93-95.

［8］黄文华，宋艳刚，李占永，等.广东不同产地五指毛桃药材中补骨脂素及微量元素的含量测定及质量评价［J］.西部中医药，2013，26(4):14-16.

［9］丘 琴，苏春妹，甄汉深，等.不同生产期苦玄参中苦玄参苷IA含量测定［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19(5):108-110.

［10］黄筑艳，张吉明.HPLC测定妇炎净软胶囊中阿魏酸的含量［J］.长春师范学院学报，2010，29(1):75-76.

［11］李 明，陈志维，黎玉翠，等.HPLC法测定五指毛桃中补骨脂素和芹菜素的含量［J］.中药新药与临床药理，2009，20(1):53-54.

［12］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:174.