2-APB对自发性高血压大鼠脑微动脉平滑肌细胞缝隙连接的影响

王洋，马克涛，张雯，李 丽，赵磊，魏丽丽，司军强

（石河子大学医学院生理学教研室/新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，石河子 832002）

血管平滑肌细胞在成年个体是一种高度特化的细胞，具有收缩、调节血管张力和维持血压等功能[1]。血管紧张度的增加是高血压发病的关键，而血管平滑肌舒缩是依赖细胞间的信号物质进行调节的。由缝隙连接蛋白构成的细胞间直接通讯，缝隙连接在调节血管同步舒缩、血管平滑肌细胞增殖、平滑肌表型转变中起着重要作用，并与高血压发生密切相关[2-4]。

Mao等[5]发现应用缝隙连接阻断剂庚醇通过阻断心肌细胞间的缝隙连接通讯，可起到对心肌的保护作用。Loewnestein等[6]发现细胞间传导可由离子及代谢物调节，并提出Ca2+对细胞间的缝隙连接有调节作用，即在缝隙连接电导的调节中，Ca2+起着关键性作用。而钙释放激活钙通道抑制剂2-氨基乙基二 苯 硼 酸 酯 （2-Aminoethoxydiphenyl borate，2-APB）[7]已被证实可以抑制大鼠血管平滑肌细胞在血清刺激下发生表型转换与增殖，是潜在的抗血管增殖的药物，我们探讨作为非选择性的缝隙连接阻断剂，2-APB是否能够对高血压微动脉起到一定的保护作用。因此，本实验在急性分离正常血压Wistar大鼠 (Wistar Rat,WR)和自发性高血压大鼠（Spontaneously Hypertensive Rat,SHR）脑微动脉标本上应用全细胞膜片钳技术，观察2-APB对SHR脑脑微动脉平滑肌细胞间缝隙连接的影响，初步探讨缝隙连接与原发性高血压疾病及2-APB可能为高血压疾病临床治疗提供更多的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择20周龄雄性SHR及正常血压WR，分别购自北京维通利华实验动物有限责任公司（许可证编号SCXK京2007-0001）和新疆医科大学实验动物中心（许可证编号SCXK新2003-0001）。

1.2 主要试剂、仪器和溶液

2-氨基乙基二苯硼酸酯 （2-Aminoethoxydiphenyl borate，2-APB）、木瓜蛋白酶（Papain）、胶原酶 IA（Collagenase IA）、BSA、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、多聚赖氨酸均由 Sigma公司提供，其余试剂均为国产分析纯试剂。

BP-6无创血压监测仪 （四川成都泰盟公司），Axon 700 B放大器（美国Axon公司），P-97拉制仪（美国Sutter公司）等。

生理盐缓冲溶液中 （mmol/L）：NaCl 138.0，KCl 5.0，CaCl21.6，MgCl21.2，Na-HEPES 5.0，HEPES 6.0，Glucose 7.5。细胞分离液成分为（mmol/L）：NaCl 142，KCl5，CaCl20.05，MgCl21，Na-HEPES 4，HEPES 5，Glucose 7.5。 电极内液成分是（mmol/L）：K-gluconate 130，NaCl 10，CaCl22.0，MgCl21.2，HEPES 10，EGTA 5，Glucose 7.5。

1.3 方法

1.3.1大鼠无创尾动脉血压测定

大鼠于40℃预热适应15 min后，用BP-6无创血压监测仪测量大鼠清醒安静状态下尾动脉的血压以测量3次后平均值为大鼠收缩压。

1.3.2大鼠脑微动脉段的分离及动脉平滑肌细胞的制备[8]

将大鼠在麻醉状况下放血处死，迅速取出大脑，置于在生理盐溶液中，迅速分离出脑动脉及其分支。

脑微动脉段标本制备：将截取好的脑微动脉段（直径＜100 μm）标本置于培养皿中，一端固定在多聚赖氨酸处理过的培养皿底部，在37℃温箱中用含有胶原酶IA（1.5 mg/mL）的生理盐溶液处理15-16 min，生理盐溶液置换2次去除残存酶液，使用显微镊在解剖镜下进一步去除其外层结缔组织。将处理好的标本用铂金片固定于培养皿中央后转移至光学显微镜下进行全细胞膜片钳实验。

单个平滑肌细胞制备：将脑微动脉置于细胞分离液中20 min，将脑微动脉剪成几段放入消化液后，在37℃温箱中消化10-15 min，消化液成分包括（mg/mL）：Papain 0.75，Collagenase IA 1，BSA 3.75，DTT 0.3。1000 r/min离心6 min后弃上清液，加入细胞分离液制成细胞悬浮液，如此反复替换3次后，将液体移至清洁、干燥的培养皿内，静置15-20 min使细胞贴壁[8]。

1.3.3全细胞膜片钳记录[9-10]

在22～25℃条件下给予标本持续灌注生理盐溶液（0.2 mL/min）进行全细胞膜片钳实验。记录电极阻抗为5～8 MΩ，通过微操纵器接触到细胞后给予负压形成GΩ高阻封接，膜电流用10 kHz（-3 dB）低频滤过。

生物电信号通过PC计算机记录，钳制电压为-40 mV，从-140 mV至+60 mV给予去极化脉冲刺激，阶跃为20 mV。细胞膜电容通过公式C=Q/V获得，电极电阻（Ra）引起的实际钳制电压（Vm）与命令电压（Vc）误差通过公式：Vm=Vc-I×Ra 进行补偿。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 SHR和WR尾动脉血压

SHR 的收缩压为（217.7±9.6）mmHg（n=8），明显高于正常 WR 的收缩压（123.2±0.6）mmHg（n=8）（P＜0.01）。

2.2 SHR脑微动脉平滑肌细胞间缝隙连接耦联力增强

WR和SHR脑微动脉平滑肌细胞膜电导分别是（3.76±0.31）nS 和（6.89±0.90）nS，差异有统计学意义（P＜0.05）。 细胞膜电阻分别是（269±37）MΩ 和（126±26）MΩ 差异有统计学意义（P＜0.05）。细胞膜电容分别是（81±18）pF 和（168±44）pF，差异有统计学意义（P＜0.05）（表 1）。

表1 2-APB对脑微动脉段上平滑肌细胞膜电生理特性的影响Tab.1 Influence of 2-APB on the membrane properties of smooth muscle cells in cerebral arteriolar in wholecell confguration

2.3 2-APB抑制WR和SHR脑微动脉平滑肌细胞间缝隙连接

2-APB对WR和SHR脑微动脉段上平滑肌细胞 Rinput、Ginput和 Cinput的影响， 结果发现应用 100 μmol/L 2-APB 后细胞的 Rinput、Ginput和 Cinput与单个平滑肌细胞数值十分接近（表1）。此外，对正常WR和SHR细胞膜电容充放电用单指数方程分别进行拟合（图1A和B中虚线部分），应用2-APB前拟合效果较差（r≤0.90），给予 100 μmol/L 2-APB 后拟合效果很好（r＞0.96），且细胞 Cinput的充放电的时间也显著降低。

图1 2-APB抑制WR和SHR平滑肌细胞间缝隙连接Fig.1 2-APB inhibits the gap junctions between the smooth muscle cells of WR and SHR

WR和SHR脑微动脉平滑肌细胞膜电位分别是（-39.18±4.03）mV 和（-40.45±3.59）mV，差异无统计学意义 （P＞0.05，n=12）。 应用ramp刺激发现，2-APB净电流 I/V曲线几乎是线性 （图2），且2-APB净电流翻转电位点与脑微动脉段上平滑肌细胞静息膜电位 （-40～-60 mV）十分接近。提示2-APB主要抑制脑微动脉平滑肌细胞间的缝隙连接，减少细胞的Ginput。

图2 2-APB净电流的I/V曲线Fig.2 2-APB induces net current I-V curves

2-APB对WR和SHR脑微动脉平滑肌细胞间缝隙连接的抑制具有浓度依赖性（图3），0.001～100 μmol/L的2-APB可以浓度依赖的抑制脑微动脉平滑肌细胞Ginput（n=6）。2-APB抑制WR和SHR脑微动脉段上平滑肌细胞Ginput的IC50分别为0.21 μmol/L和0.83 μmol/L，两组脑微动脉间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

图3 2-APB浓度依赖的抑制WR和SHR平滑肌细胞Fig.3 Concentration-dependent inhibition by 2-APB on the membrane input conductance（Ginpt）of the smooth muscle cells in WR and SHR

3 讨论

众所周知，哺乳动物的缝隙连接通道由一个十分相近的基因家族所编码，1个缝隙连接通道由2个头一头相接的半通道连接子共同围成的一个水相通道。亲水通道的膜电位下降、pH值变小或胞液内游离Ca2+浓度升高均可改变缝隙连接蛋白的构象而使其管腔变小甚至关闭，这在生物学上可能起保护作用[11]。研究发现，特异性敲除血管内皮细胞连接蛋白43和连接蛋白40基因后，小鼠出现高血压和心肌肥厚[12]。在高血压疾病状态下，大鼠肠系膜动脉、尾动脉、大脑中动脉及先兆子痫患者视网膜动脉等阻力血管舒缩的振幅较正常血压者显著升高[13-14]，其可能的意义是SHR通过提高血管平滑肌细胞间的电化学信息传递，保证血管舒缩的同步性。Azzam[2]等也证实缝隙连接在调节血管舒缩、血管平滑肌细胞增殖和平滑肌的表型转变中起着重要作用，并与高血压发生密切相关。

脑动脉血管上缝隙连接通道广泛分部于平滑肌细胞间、内皮细胞间以及平滑肌细胞和内皮细胞间[13]，我们前期的研究发现在肠系膜动脉三级分支预灌流2-APB 100 μmol/L后使KCl和PE引起的血管收缩均显著降低，其中SHR降低幅度更加显著[15]；本实验发现2-APB能够浓度依赖性的抑制脑微动脉平滑肌细胞间缝隙连接，且抑制WR和SHR脑微动脉段上平滑肌细胞Ginput的IC50分别为0.21 μmol/L和0.83 μmol/L，两组脑微动脉间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。以上结果提示：一定浓度的2-APB可能通过降低SHR大鼠血管平滑肌细胞间缝隙连接通讯对SHR阻力血管舒缩起到一定的保护作用，其具体机制还有待进一步研究。

目前，一方面，2-APB能够非选择性地抑制血管平滑肌细胞间的缝隙连接[7,15]；另一方面，对于2-APB的作用研究的最多的也是最可靠的，就是它能够通过调节钙释放激活钙通道的活性，其作用是双向的，即低浓度促进、高浓度抑制钙释放激活钙通道电流，可以有效抑制血管平滑肌细胞的表性转换和增殖[7]，与Azzam[2]的结果一致，以上结果均提示2-APB通过抑制平滑肌细胞表型的转换和增殖影响高血压的发生过程。此外，Ca2+对细胞间的缝隙连接有调节作用，即在缝隙连接电导的调节中，Ca2+起着关键性作用[15]，而2-APB能够通过调节钙释放激活钙通道的活性而影响钙池操纵的Ca2+内流。本研究在急性分离的两组大鼠脑微动脉上，应用2-APB浓度≥100 μmol/L(抑制钙释放激活钙通道电流)时可以完全阻断WR和SHR脑微动脉平滑肌细胞间的缝隙连接；且2-APB对SHR脑微动脉段上平滑肌细胞Ginput的IC50高于WR，提示2-APB可以通过抑制缝隙连接电化学通讯减少伤害性刺激的信号传递。

总之，本研究中我们应用膜片钳技术对2-APB作用于SHR脑微动脉平滑肌间缝隙连接的影响做了初步研究，提示SHR较WR脑动脉平滑肌细胞间的缝隙连接的表达或功能增强，促使缝隙连接耦联力增强，保持了血管舒缩的同步性；对于2-APB抑制SHR脑微动脉平滑肌细胞的增殖，这对了解2-APB对高血压的调节机制，以及其在潜在的治疗作用中具有重要的意义，可能为临床能治疗高血压提供更多的思路。

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