茯苓酸性多糖分级提取及其抗肿瘤活性比较△

卢燕，卢华杰，刘焱文

(湖北中医药大学 药学院 中药资源与中药化学省级重点实验室，湖北 武汉 430061)

“十二五”国家科技支撑计划(2010BAE00386)

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刘焱文，Tel：(027)88920834；E-mail：ywliu2008@163.com

茯苓酸性多糖分级提取及其抗肿瘤活性比较△

卢燕，卢华杰，刘焱文*

(湖北中医药大学 药学院 中药资源与中药化学省级重点实验室，湖北 武汉 430061)

目的以不同碱度分级提取茯苓酸性多糖，进行抗肿瘤活性比较研究，以期探讨茯苓酸性多糖的构效关系。方法将茯苓饮片分别用70%乙醇和水提取后的药渣，依次用0.1～1.0 mol·L-110个梯度氢氧化钠(NaOH)溶液分级提取，得到10种茯苓酸性多糖组分提取物；采用MTT法测定对HepG2肿瘤细胞抑制率，比较10种分级酸性多糖体外抗肿瘤活性大小。结果0.9和1.0 mol·L-1NaOH提取的茯苓酸性多糖对肿瘤细胞抑制率最高。结论茯苓酸性多糖抗肿瘤活性与其酸性强弱相关。

茯苓；酸性多糖；分级分离；抗肿瘤活性

茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.) Wolf的干燥菌核，是药食两用的传统中药大品种，始载于《神农本草经》，列为“上品”[1]；收载于历版《中国药典》一部，具有利水渗湿、健脾、宁心的功能。茯苓多糖是茯苓的主要成分，其含量可达茯苓干重的80%以上。现代药理研究表明，茯苓多糖经降解和结构修饰后具有抗肿瘤作用。谈新提等[2]将茯苓多糖羧甲基化、硫酸酯化产物进行抗肿瘤药理实验研究，显示良好的抗肿瘤生物活性。赵吉福等[3]对磺酰化茯苓多糖进行体内抗肿瘤作用研究，其抗肿瘤活性明显。但是，迄今尚未见国内外有关茯苓酸性多糖直接用于抗肿瘤作用的报道。本实验室前期对茯苓多糖进行了系统研究，表明茯苓多糖以酸性多糖为主，为总多糖含量的90%以上，其动物模型实验具有显著性药理作用[4]。为了探讨不同酸度茯苓多糖抗肿瘤生物活性，笔者采用0.1～1.0 mol·L-1梯度浓度氢氧化钠(NaOH)溶液分级提取茯苓酸性多糖，依次提取分离到10种酸性多糖组分，并进行了抗肿瘤活性的比较研究，以期为进一步探讨茯苓多糖构效关系奠定基础。

1 材料与仪器

1.1 仪器

JJ-1增力电动搅拌器(金坛市宏华仪器厂)，FD-1A-50冷冻干燥仪(北京博医康实验仪器有限公司)，Forma series IICO2Water Jacketed恒温培养箱(Thermo electron)，Multiskan MK3型酶标仪(Thermo electron)，AL204型万分之一分析天平(瑞士Metter Toledo公司)。

1.2 药物与试剂

茯苓购自湖北罗田九资河，经湖北中医药大学鉴定教研室张秀桥老师鉴定为正品。HepG2人肝癌细胞(武汉大学余建清教授提供)、DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、青霉素-链霉素购自HyClone公司，胎牛血清购自GIBCO公司，二甲基亚砜(DMSO)、MTT粉末购自AMRESCO公司，水为自来水，氢氧化钠(NaOH)、盐酸(HCl)等试剂均为分析纯。

1.3 供试溶液的制备

1.3.1 分级茯苓酸性多糖的提取分离 称取茯苓块100 g，用70%的乙醇和水回流提取后的药渣，用70倍量0.1 mol·L-1NaOH溶液室温搅拌提取2 h，500目滤布过滤，滤液用20% HCl中和，得到茯苓酸性多糖组分混悬液；其滤渣依次用0.2～1.0 mol·L-1梯度NaOH溶液分级提取分离，得到9个茯苓酸性多糖组分混悬液，分别将10种分级茯苓酸性多糖混悬液通过分子截留量为3 500的透析袋透析，直至透析液用硝酸银检测为阴性；将除盐后的分级多糖冷冻干燥，即得到10种分级茯苓酸性多糖干燥品，制备结果见表1。

表1 分级多糖编号及收率

1.3.2 分级茯苓酸性多糖供试溶液制备 精密称定不同多糖样品，将样品溶于DMSO，用培养基稀释成终浓度为100 μg·mL-1，备用。

2 方法

2.1 细胞的培养与铺板

将处于对数期的HepG2细胞，调整细胞悬液的浓度，为1×106个·mL-1，于96孔板中每孔加入100 μL的细胞悬液，37 ℃，5% CO2培养24 h，至细胞单层铺满孔底。

2.2 给药

取出96孔板，吸弃原来的培养基，每孔加入100 μL药液，每组设3个复孔，置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养24 h。

2.3 染色

药物作用24 h后，向每孔加入5 mg·mL-1的MTT溶液20 μL，置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养4 h。

2.4 测定

MTT作用完成后，吸去培养基和MTT，每孔中加入100 μL DMSO溶液，避光、低速振荡10～20 min，至紫色结晶充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的OD值，记录并计算抑制率。

3 结果

分级酸性多糖对肿瘤抑制率见表2和图1。由表2和图1可知，茯苓酸性多糖分级提取分离的10个组分样品均具有不同程度的抑制肿瘤细胞的生物活性，其中PAP9和PAP10对肿瘤细胞的抑制率明显高于其他各组分多糖。

表2 分级多糖样品肿瘤抑制率

注：(1)各级多糖浓度为100 μg·mL-1；(2)与PAP1比较，*P<0.05，**P<0.01

图1 分级酸性多糖对肿瘤抑制率的比较

4 讨论

茯苓的主要物质成分为多糖，其含量达80%以上，国内外诸多文献报道，茯苓羧甲基多糖具有抗肿瘤生物活性。本实验室前期研究表明，茯苓多糖以酸性多糖为主，占总多糖含量的90%以上；将茯苓酸性多糖直接进行了抗肿瘤、调节免疫功能及阿霉素致肾病模型的药效学研究，均具有显著的药理效果。

为了探讨茯苓酸性多糖的生物活性与其酸性强弱和分子量大小的相关性，笔者采用0.1～1.0 mol·L-1梯度NaOH溶液将茯苓酸多糖分级分离为10个组分，进行抗肿瘤生物活性比较研究。研究结果表明，各分级组分茯苓酸性多糖均有不同程度抗肿瘤活性，但0.9，1.0 mol·L-1NaOH溶液分级分离得酸性多糖抗肿瘤活性明显高于其他分级组分酸性多糖。说明茯苓酸性多糖抗肿瘤活性与其酸性强弱密切相关，弱酸性多糖抗肿瘤活性优于强酸性多糖，从而为进一步探讨茯苓酸性多糖的构效关系奠定了基础。

茯苓酸性多糖构效关系有待进一步深入研究，拟在本文研究基础上，对茯苓酸性多糖分级分离10个组分多糖的分子量、单糖组成及其连接方式等进行系统研究。以期阐明茯苓酸性多糖的构效关系，从而为茯苓多糖的深度开发利用提供科学依据。

[1] 郑威，茯苓多糖及其修饰物抗肿瘤作用及机制研究进展[J].健康研究，2011，31(5)：379-381.

[2] 谈新提，王艺峰，张丽娜，等.化学修饰的茯苓多糖抗肿瘤效应的组织学观察[J].武汉大学学报(医学版)，2004，25(6)：652-683.

[3] 赵吉福，么雅娟，陈英杰，等.磺酰化新茯苓多糖的制备及抗肿瘤作用[J].沈阳药科大学学报，1996，67(2)：125-138.

[4] 邓媛媛，邵贝贝，王光忠，等.茯苓调节免疫功能有效物质的比较研究[J].中国医药指南，2012，12(10)：94-95.

[5] 张文女，黄金龙.茯苓多糖的抗肿瘤作用[J].中草药，1990，30(7)：38-39.

PoriaAcidicPolysaccharidesExtractGradingandItsAntitumorActivity

LUYan，LUHuajie，LIUYanwen*

(HubeiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Wuhan430061，China)

Objective：To extract different grading Poria acidic polysaccharides，analyzed its anti-tumor activity in order to investigate the Poria acidic polysaccharides structures-efficacy relationship.MethodsPoria pieces were extracted residue by water and 70% ethanol，washed with 0.1-1.0 mol·L-1NaOH solution of gradient extraction procedure，get 10 Poria extract acidic polysaccharides，using the MTT assay of HepG2 tumor cells inhibition rate compared 10 kinds of grading acidic polysaccharides antitumor activity in vitrosize.Results0.9 and 1.0 mol·L-1NaOH acidic polysaccharides extracted from Poria had highest inhibition rate to tumor cells.ConclusionPoria antitumor activity of acidic polysaccharides associated with their acidities.

Poria；Acidic polysaccharides；Fractionation；Antitumor activity

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.02.004

2013-07-12)