拟黑多刺蚁（Polyrhachis vicina）性腺雌激素相关受体基因的表达

欧阳霞辉，侯兰新，高丹丹，陈 红

（西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州730030）

在哺乳动物中，雌激素及其受体既影响乳腺、子宫和卵巢等生殖系统的生长、分化及功能，又对骨骼、心血管系统和中枢神经系统发挥作用［1］.雌激素受体一旦与雌激素结合，就会发生变构形成二聚体，然后与雌激素受体反应元件（estrogen response element，ERE）结合，刺激靶基因转录，从而调节雌激素促进细胞增生、分化和维持正常的生理功能［2］.ERR（Estrogen related receptor，ERR）属于孤儿核因子受体，在结构上和ER非常类似，它们和ER共同构成核因子受体超家族的第三亚族，能够直接与类固醇受体共激活子结合激活靶基因的表达 .与ER不同的是，它们不与雌激素结合，但能够与雌激素应答元件结合［3］，表明在与共同的共激活子作用时它们之间存在相互竞争作用［4］.

哺乳动物ERRs存在于ERs存在的多种靶器官和组织 .对鼠类的研究发现，ERRα在各种胚胎组织中都有表达，在胚胎干细胞中也能检测到ERRαmRNA的表达，表明ERRα与众多生理和发育过程有关 .几乎在老鼠每一种成体组织中都有ERRα表达，而且在大脑、心脏、骨骼肌、肾、精巢和子宫等部位有高度表达［5，6］.ERRα在ERα存在的丘脑和视丘下部和垂体前叶也有表达，推测它也可能参与了生殖调控，对ERα的表达起反馈调节作用［5］.ERRβ的mRNA表达从原始生殖细胞迁移到生殖脊开始，一直持续到两性性别出现，ERRβ缺失引起生殖腺生殖细胞的数量明显减少，表明ERRβ明显参与了生殖腺生殖细胞的增殖［7］.

尽管对哺乳动物ERR的研究比较深入，但在昆虫类，虽然Genebank中存在一些昆虫ERR的序列，也有对黑腹果蝇dERR配体的研究报道［8］，但是有关ERR功能的研究很少 .何慧等对黄脸油葫芦雌激素相关受体TeERR的研究也发现，TeERR与黄脸油葫芦的发育有关，在幼虫的胚胎期和生殖腺表达量很高［9］.为了了解pvERR在性腺中的表达情况，我们采用原位杂交技术对拟黑多刺蚁蚁后卵巢中和雄蚁精巢中pvERR mRNA的表达进行了定位研究，以期为进一步的功能研究奠定基础.

1 材料与方法

1.1 实验材料

以本实验室饲养的拟黑多刺蚁（Polyrhachis vicina）蚁后和雄蚁为研究对象 .饲养条件：温度25～28℃，相对湿度80%，光周期12L∶12D.饲料为20%的白糖水和豆饼菜叶.采用经过消毒的刀片迅速分别将蚁后、雄蚁的腹部切下，立即放入含有0.1%DEPC的多聚甲醛固定液中固定8h.

1.2 原位杂交

拟黑多刺蚁ERR原位杂交试剂盒（订制）购自武汉博士德生物工程公司，试剂盒包括：胃蛋白酶；预杂交液；ERR寡核苷酸探针杂交液（根据所测拟黑多刺蚁ERR序列设计，5＇-tgaagcatatctggctcgcaagctgctaaggc-3＇，地高辛标记），封闭液，生物素化鼠抗地高辛，SABC，生物素化过氧化物酶.

将固定好的材料放入30%蔗糖溶液中于4℃过夜，用冰冻包埋剂包埋，切片 .切片厚15μm，将切片粘于载玻片上，晾干备用 .实验流程如下：①洗涤 .将贴有材料的载玻片置于高压灭菌的0.1%DEPC水中充分洗涤.②封闭内源性酶：切片入0.3%H2O2室温处理30min，0.1%DEPC水洗3次.③暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶，37℃消化5min.原位杂交用PBS洗3次，每次5min.④后固定：切片入1%多聚甲醛（含有0.1%DEPC）室温固定10min，0.1%DEPC水洗3次.⑤预杂交：每张切片滴加20μL预杂交液，恒温箱40℃预杂交4h.⑥杂交：每张切片滴加20μL杂交液，恒温箱中40℃杂交过夜.⑦杂交后洗涤：37℃2×SSC洗5min×2次；37℃，0.5×SSC洗15min×1次；37℃0.2×SSC洗15min×2次.⑧滴加封闭液：37℃，30min.⑨滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃，60min，原位杂交用PBS洗4次，每次5min.⑩滴加SABC：37℃，30min，原位杂交用PBS洗3次，每次5min.[11]滴加生物素化过氧化物酶：37℃，30min，原位杂交用PBS洗4次，每次5min.[12]DAB显色：镜下控制反应时间，一般5～10min，蒸馏水终止反应 .梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片.Leica光学显微镜观察.

阴性对照实验是以预杂交液代替杂交液进行，其余步骤同上.

1.3 图像分析

应用Leica QWinV3图像分析系统分别统计阳性反应的平均灰度值（灰度分级为0～255级，0级为最黑的灰度，255级为最浅的灰度）.精巢和卵巢分别取5张组织切片，每张切片取6个视野，统计灰度值，应用SPSS 11.5的one-way ANOVA进行统计学分析 .数据符合正态分布，经方差齐性检验后进行单因素方差分析，并进行LSD检验.

2 结果

2.1 拟黑多刺蚁蚁后卵巢pvERR基因的表达

采用地高辛标记的特异寡核苷酸探针杂交结果显示，pvERR mRNA在分化期早期的滤泡细胞胞质中就有表达，一直持续到卵黄积累阶段（图版Ⅰ，1-4）；生长期和卵黄形成期的卵母细胞胞质中有pvERR mRNA阳性反应（图版Ⅰ，3-4）.

2.2 拟黑多刺蚁雄蚁精巢pvERR基因的表达

变形期精细胞胞质有pvERR mRNA阳性反应（图版Ⅱ，1）.成熟精子的头部和尾部有不同程度的pvERR mRNA阳性表达（图版Ⅱ，2-3）.

2.3 对照

以预杂交液代替杂交液的对照实验结果为阴性（图版Ⅰ，5-6；图版Ⅱ，4）.

2.4 图像分析及统计结果

结果表明，卵子发生中，pvERR mRNA在滤泡细胞各个时期的表达差异显著 .在生长期和卵黄形成期的卵母细胞表达差异显著 .卵黄形成期卵母细胞和滤泡细胞中的表达差异不显著（表1）.精巢中，pvERR mRNA在变形期精细胞和成熟精子头部和尾部的表达差异显著（表1）.

表1 拟黑多刺蚁精卵发生过程中pvERR mRNA原位杂交阳性反应灰度值

图1 pvERR mRNA在拟黑多刺蚁卵巢中的表达

3 讨论

昆虫的生殖虽然受外界环境因子的影响，但主要受昆虫体内的内分泌系统调节 .外在因素的作用，常先刺激昆虫的感受器官，所产生的冲动传入神经系统，由此影响内分泌系统的活动，内分泌系统的化学信息传递到生殖器官，使后者产生相应的生理反应，生殖腺的活动又能对内分泌系统产生反馈式调节作用［10］.在昆虫脑中存在促性腺激素（Gonadotrophins，GtH），昆虫性腺成熟及精卵成熟也依赖脑分泌的促性腺激素调节，它能诱导卵巢和精巢合成蜕皮激素，而蜕皮激素能够促使脂肪体合成卵黄原蛋白、卵胞细胞的分化以及刺激精子的发生［11～14］.

3.1 pvERR基因在卵巢中的表达

拟黑多刺蚁卵巢属于多滋式 .滋养细胞和卵母细胞都是由早期的卵原细胞通过有丝分裂产生，一个卵母细胞周围有几十个滋养细胞 .滋养细胞通过染色体大量复制，使其转录活性升高，合成大量rRNA、mRNA，甚至完整的核糖体，并通过细胞质桥单向运输给处在发育阶段的卵母细胞 .在卵母细胞发育的一定阶段滋养细胞分解，分解产物进入卵母细胞 .滤泡细胞是体细胞，卵子发生早期阶段，夹杂在生殖细胞之间 .随着卵母细胞的发育，它包围在卵母细胞和滋养细胞周围形成滤泡壁 .滤泡细胞不仅为卵母细胞提供营养物质的积累，并形成卵黄膜和卵壳，并且在卵母细胞发育的过程中提供发育信息［15］.

图2 pvERR mRNA在拟黑多刺蚁精巢中的表达

本研究中原位杂交结果显示，pvERR mRNA在卵子发生过程中滤泡细胞的胞质都有阳性表达.随着卵母细胞的生长，滤泡细胞中的表达量逐渐增加 .在卵黄积累阶段，pvERR mRNA的表达量显著减少 .而在卵母细胞，pvERR mRNA在生长期和卵黄发生期表达，表达量是逐渐增加的 .在卵子发生分化阶段，随着滋养细胞和卵母细胞分化，滤泡细胞不断增殖分裂，所以该时期pvERR mRNA的阳性表达可能与滤泡细胞自身的增殖和分化有关 .卵母细胞生长期和卵黄积累阶段，滤泡细胞和卵母细胞中pvERR mRNA的阳性表达趋势（滤泡细胞中逐渐减少，卵母细胞中逐渐增多）可能说明滤泡细胞给卵母细胞提供了发育信息 .卵黄生成期卵母细胞中pvERR mRNA的表达可能说明pvERR与卵黄物质的形成有关 .蜕皮激素受体通过信号通路调控卵母细胞的发育，控制卵黄蛋白的合成［16～18］.而研究表明，蜕皮激素受体和雌激素受体的信号转导途径非常相似［19～20］，所以推测pvERR可能也是通过蜕皮激素受体信号通路来发挥作用的.

3.2 pvERR基因在精巢中的表达

昆虫精子的发生一般包括三个阶段：第一阶段主要在胚胎发育时就已经完成，指精原干细胞在迁移到生殖嵴途中及生殖嵴中进行多次有丝分裂，精原干细胞的数目增加；第二阶段指幼虫期的精原干细胞经过增殖和更新成精原细胞，精原细胞经过两次连续的减数分裂产生四个精子细胞；第三阶段是精子形成期，大多数种类在成虫羽化时已经有成熟的精子 .在成熟的拟黑多刺蚁雄蚁精巢，本研究中没有观察到精子发生早期的精原细胞和精母细胞，可能说明在变态为成虫之前精子发生就已经开始，生精细胞发育的同步性比较高.通过原位杂交发现，变形期的精细胞胞质和成熟精子头部有很强的pvERR mRNA表达，说明pvERR可能参与了精细胞的发育调控和精子的成熟 .对东亚飞蝗体外抑制实验研究发现，蜕皮激素对于飞蝗精子发生是必需的，能够保证产生正常发育的精细胞和精子［16］.所以推测pvERR可能通过蜕皮激素受体信号途径对精子进行调控.

4 结论

采用地高辛标记的特异性寡核苷酸探针对拟黑多刺蚁性腺中pvERR mRNA的表达进行了原位杂交检测，结果显示：pvERR mRNA在卵子发生过程中滤泡细胞的胞质和生长期、卵黄发生期的卵母细胞有表达，在变形期的精细胞胞质和成熟精子头部有很强的表达 .在卵子发生分化阶段，pvERR mRNA的阳性表达可能与滤泡细胞自身的增殖和分化有关 .卵母细胞生长阶段，滤泡细胞和卵母细胞中pvERR mRNA的表达模式可能说明滤泡细胞给卵母细胞提供了发育信息，而卵黄生成期卵母细胞中pvERR mRNA的表达可能说明pvERR与卵黄物质的形成有关 .变形期的精细胞胞质和成熟精子头部pvERR mRNA的表达，说明pvERR可能参与了精细胞的发育调控和精子的成熟.

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