大鼠动脉钙化诱导过程中炎症小体复合物分子的变化

彭利静，李慧，李超民

解放军第451医院 心血管内科，陕西 西安 710054

动脉钙化是指钙盐沉积在动脉壁组织的一种病理改变。人体内的钙主要以羟基磷灰石的形式存在于骨骼和牙齿中，当动脉钙化发生时，钙会以磷酸钙的形式沉积在脉管系统，导致动脉钙化的发生。沉积在脉管系统的磷酸钙会减少主动脉和支动脉的弹回率，从而改变心血管系统的血液流动力学，导致高血压、主动脉瓣狭窄、心脏肥厚、心肌和下肢缺血、充血性心力衰竭，因此导致死亡率上升[1-3]。这种钙化可以发生在不同部位（心脏瓣膜、动脉内膜和中膜、毛细血管等），可呈局部、集中或弥散的钙化，由此导致的损伤会引起急性炎症和钙代谢的平衡失调[4]。

钙化多发生于老年人中，随着生活水平的提高，血管疾病发生率呈上升趋势，而发病年龄呈年青化趋势，其中血管钙化较普遍。许多疾病早期都发生炎症反应，炎症反应在钙化发生过程中同样起着重要的作用。我们以大鼠动脉钙化为模型，研究了钙化发生过程中NALP3炎症小体复合物分子的变化情况。

1 材料和方法

1.1 材料

4周龄SD大鼠，体质量150 g左右，订购于军事医学科学院实验动物中心；DMEM培养基购自Gibco公司；小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；卵磷脂购自北京化学试剂公司；猪源胆酸购自国药集团；β-磷酸甘油酯购自北京欣经科生物技术有限公司；反转录试剂盒购自Promega公司；TRIzol购自天根公司；引物由北京奥科公司合成。

1.2 维生素D3注射液的配制

溶液A：0.6 g卵磷脂溶于260 μL无水酒精，制成卵磷脂溶液；25.5 mg VD3溶于卵磷脂溶液，加入0.75 g玉米油，充分振荡溶解。溶液B：26 mg胆酸溶于7.3 mL生理盐水。将溶液A溶于溶液B中，在振荡器上充分振荡，所得溶液为乳浊注射液。

1.3 大鼠动物模型的建立

SD大鼠42只分为对照组和钙化组，对照组6只，钙化组36只。钙化组按时间梯度（0.5、1、3、7、14、28 d）分为6组，每组6只。钙化组给予VD3注射液，剂量为30万U/（kg·d），连续注射14 d，每天同一时间皮下注射。在不同时间点收取钙化大鼠，取其主动脉，放入无RNAase的离心管中，冻存于-80℃。

1.4 HE染色

将制好的石蜡切片在二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各脱蜡10 min，苏木素染色5 min，蒸馏水冲洗2 min，用1%的盐酸乙醇分化3 s，蒸馏水冲洗2 min，伊红染色2 min，蒸馏水冲洗5 min，梯度乙醇溶液（50%、70%、80%、95%）脱水，晾干后用中性树胶封片。

1.5 RNA提取及半定量PCR

收取大鼠动脉组织，加入1 mL TRIzol裂解，用玻璃棒研磨，用氯仿和异丙醇抽提总RNA，用75%的乙醇洗涤RNA沉淀物，DEPC水溶解RNA，-80℃保存。取 2 μg总 RNA，在含 1.5 μL oligo（dT）、5 μL dNTP混合液、1 μL M-MLV反转录酶、0.625 μL核糖核酸酶抑制剂、5 μL M-MLV缓冲液的20 μL体系中逆转录成cDNA。取2 μL逆转录产物作为模板，分别进行PCR扩增基因。引物为Rat nalp3-上游（5'GACCAGGAGGTTGTTCAGATCTTC3'）、Rat nalp3-下 游（5'TCCATTCTGGTAGAGAGGTTGATC 3'）、Rat ASC-上游（5'ACCACACCCTTGCACAGCC TATC3'）、Rat ASC-下游（5'CACATTGCCATACAG AGCATCCAG3'）、Rat Caspase-1-上游（5'GTGAGT GTAGGGACAATAAATGGA3'）、Rat Caspase-1- 下游（5'CTAAAGGGCAAAACTTGAGGGAAC3'）、Rat β-actin-上游（5'CACCCGCGAGTACAACCTTC3'）、β-actin-下游（5'CCCATACCCACCATCACACC3'）。PCR反应体系为20 μL，扩增条件为95℃预变性5 min、95℃变性45 s、58℃退火30 s、72℃延伸1 min。

2 结果

2.1 大鼠动脉钙化模型的建立

我们以SD大鼠作为实验对象制备动物钙化模型，取其主动脉血管制备石蜡切片，HE染色显示主动脉中膜和内膜钙化情况，见图1。未给予VD3组大鼠主动脉中膜和内膜完整，给予VD3组大鼠主动脉中膜和内膜因发生钙化而断裂。

2.2 NALP3炎症小体相关基因在钙化模型中被激活

我们进一步确定NALP3炎症小体在体内钙化模型中的情况。4周龄SD大鼠按不同时间点（0、0.5、1、3、7、14、28 d）皮下注射VD3，对照组注射除VD3外的溶剂，于不同时间点处理大鼠。提取大鼠的主动脉总RNA，RT-PCR检测NALP3炎症小体基因的表达差异。结果如图2所示，以β-actin为内参，在0.5 d时NALP3炎症小体基因（NALP3、ASC、Cas⁃pase-1）转录水平开始上升，并持续上升至钙化诱导第7 d，在钙化后期（14、28 d）转录水平下降，这表明NALP3炎症小体在动物钙化早期被激活。

图1 大鼠钙化模型的建立

图2 NALP3炎症小体在体内钙化模型中被激活

3 讨论

文献报道的大鼠动脉钙化模型的制作方法主要有维生素D3加尼古丁法[5]、维生素D3加华法令法[6]和单用维生素D3法[7]。研究表明[8]，维生素D3能显著促进动脉钙化的发生。经皮下注射维生素D3后，血钙浓度显著升高，并破坏动脉管壁的完整性，但具体机制不明确。本实验采用单用维生素D3法，皮下注射给予实验组大鼠大剂量VD3，制作了大鼠动脉钙化模型，经病理（HE染色）证实模型制作成功，可见动脉中膜弹力层和内膜大量被破坏，由于制片过程中有部分钙盐脱落，造成中层有空白形成。

炎症小体是一种胞内模式识别受体复合物，主要应答进入胞内的病原相关分子模式（pathogen-as⁃sociated molecular pattern，PAMP），通过分泌IL-1β参与宿主先天性免疫反应。研究表明，一些晶体结构物和外来蛋白聚集体可以激活NALP3信号通路，如尿酸单钠（monosodium urate，MSU）和引起自发炎症痛风和关节炎的焦磷酸钙脱水化合物（calcium pyrophosphate dehydrate，CPPD）都能激活NALP3炎症小体[9]。我们的实验表明，大鼠动脉钙化诱导过程中 NALP3、ASC、Caspase-1的转录水平升高，表明NALP3炎症小体的相关基因在钙化模型中被激活。这些发现为我们进一步研究动脉钙化的机制及筛选抗动脉硬化药物打下了基础。

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