重组人白细胞介素15融合蛋白的表达、纯化及免疫原性检测

李佳林，张存，高源，郝强，王舒宁，张伟，张英起

1.肿瘤生物学国家重点实验室；2.第四军医大学 药学系生物制药学教研室；陕西 西安 710032

白细胞介素15（interleukin-15，IL-15）是一种多功能细胞因子，是1994年Grabstein等从猿猴的肾上皮细胞中发现的，相对分子质量为（14～15）×103[1]。研究发现，IL-15在T细胞、NK细胞、NKT细胞及树突状细胞等免疫细胞的发育、功能维持方面发挥重要作用，被看作是天然免疫与获得性免疫系统之间的纽带之一[2]，因此在维持自身免疫系统平衡及治疗肿瘤、微生物感染、自身免疫病等方面备受关注[3-5]。

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种常见的累及外周关节为主的多系统炎症的自身免疫性疾病。大量文献报道，RA患者血清中IL-15水平明显增高，且过量表达的IL-15通过多种途径参与RA的发病机制[6]。首先，IL-15可以通过与多种细胞因子相互作用促进炎症的进展。研究发现，RA中高浓度的IL-15能诱导炎性因子IL-17的过度分泌。IL-15还能一方面直接活化T细胞诱导其合成肿瘤坏死因子α（TNFα），另一方面通过激活NK细胞，通过其与单核细胞的相互作用，促进TNFα的产生[7-9]。另外，IL-15还参与关节骨质的破坏。IL-15可以一方面通过激活促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）和NF-κB等信号通路诱导单核细胞分化为破骨细胞，另一方面与其他分子相互作用促进成骨细胞的凋亡；还可通过增加基质金属蛋白酶的分泌，造成骨质损伤[6,10-11]。因此，IL-15已成为RA治疗的重要靶点。我们从主动免疫方向入手，通过融合破伤风类毒素（tetanus toxoid，TT）T辅助细胞表位（830～843，QYIKANSKFIGITE），在体外克隆表达了重组人TTIL-15融合蛋白（以下简称为rtIL-15），并通过免疫小鼠检测其免疫原性，为进一步研究IL-15融合蛋白在治疗RA中的作用打下基础。

1 材料及方法

1.1 材料

BALB/c小鼠（雌性，6～8周龄）购自第四军医大学实验动物中心；大肠杆菌M15、质粒pQE-30均由本教研室保存；限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA marker DL2000均为大连TaKaRa公司产品；异丙基-β-硫代半乳糖苷（IPTG）、琼脂糖、琼脂购自北京鼎国生物技术有限责任公司；重组人IL-15及小鼠抗人IL-15单克隆抗体购自R&D公司；氢氧化铝佐剂购自Brenntag公司。

1.2 pQE-30-TT-IL-15重组表达载体的构建

将GenBank中人IL-15基因序列（342 bp）上游引入BamHⅠ酶切位点和TT 830～843表位，下游引入SalⅠ酶切位点，长度共计399 bp的基因序列交由北京奥科生物技术有限公司合成，克隆入载体pQE-30，转化大肠杆菌M15感受态细胞，挑单克隆培养。经酶切鉴定及上海生工生物技术服务有限公司DNA测序证实，得到重组融合表达载体pQE-30-TT-IL-15，其中pQE-30载体N端融合6个His。

1.3 rtIL-15在大肠杆菌中的表达

将含pQE-30-TT-IL-15重组质粒的工程菌接种于10 mL含氨苄西林的LB培养液中，于37℃培养过夜，次日按1%的比例转种于10 mL含氨苄西林的LB培养液中，于37℃振荡培养至对数生长早期（D600nm约为0.6），加IPTG诱导表达，于37℃振荡培养4 h，离心收集菌体，SDS-PAGE鉴定，并用灰度扫描软件分析目的蛋白占菌体总蛋白的比例。

1.4 rtIL-15融合蛋白的纯化、复性和鉴定

1.4.1 rtIL-15融合蛋白的纯化、复性 将诱导表达的工程菌液于4℃、4000 r/min离心15 min，收集菌体沉淀，超声波裂解，4℃、12 000 r/min离心20 min，分别收集上清液和沉淀进行SDS-PAGE，分析目的蛋白的表达形式。将沉淀用包涵体洗涤液A（2 mol/L尿素，2%Triton X-100）洗涤2次，离心取沉淀，用8 mol/L尿素溶解，离心后取上清进行镍柱（Ni-NTA）亲和层析纯化，分别用10、25 mmol/L咪唑预洗脱之后，用250 mmol/L咪唑再次洗脱，收集目的蛋白进行梯度透析复性（尿素浓度依次为6、4、2、0 mol/L），最后透析至Tris缓冲液中，-20℃保存。

1.4.2 rtIL-15融合蛋白的Weatern印迹 将纯化的rtIL-15行SDS-PADE，随后将其转移到PVDF膜上，以小鼠抗IL-15单抗为一抗、HRP-兔抗小鼠IgG为二抗进行Western印迹。

1.4.3 rtIL-15融合蛋白的HPLC纯度鉴定 取10 μL纯化的蛋白样品（0.5 mg/mL）上样至Beckman HPLC系统，使用7.5 mm×300 mm G2000SW凝胶柱，在280 nm波长下监测出峰情况，通过计算峰面积得出rtIL-15蛋白的纯度。

1.5 rtIL-15疫苗的免疫原性测定

1.5.1 免疫小鼠 将18只BALB/c小鼠随机分为3组，分别为rtIL-15+氢氧化铝佐剂组（蛋白与氢氧化铝按体积比1∶1混合）、rtIL-15组和生理盐水对照组。背部皮下多点注射，每只小鼠每次免疫40 μg rtIL-15/100 μL或100 μL生理盐水（对照组），每组免疫4次，每次间隔2周。第4次免疫后10 d摘眼球采血，收集抗血清进行鉴定。

1.5.2 ELISA测定血清抗体滴度 用商品化的IL-15溶液包被96孔板（每孔100 ng/100 μL），将不同组别的小鼠血清梯度稀释后加入孔中与其结合，再加入HRP标记的二抗（博士德公司），OPD显色，测定D490nm值，每个样品均设3个复孔。

2 结果

2.1 重组表达载体的鉴定

pQE-30-TT-IL-15重组表达载体（图1）构建完成后，用BamHⅠ和SalⅠ双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果显示在390 bp处出现酶切片段，与预期一致（图2）。测序结果也显示序列正确。

2.2 rtIL-15融合蛋白在大肠杆菌中的表达

工程菌经IPTG分别诱导2、3、4 h后进行SDSPAGE，出现一条相对分子质量约14 000的蛋白条带，与预期结果一致，说明rtIL-15在大肠杆菌中得到表达，并且诱导4 h后的表达量最高（图3）。灰度扫描分析，融合蛋白约占菌体总蛋白的20%。收集菌体进行超声波裂解，发现目的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在，细菌裂解液上清中（可溶性表达部分）只有少量目的蛋白（图3）。

图1 pQE-30-TT-IL-15重组载体结构示意图

2.3 rtIL-15融合蛋白的纯化、复性和鉴定

用洗涤液A洗涤包涵体2次，离心取沉淀，用8 mol/L尿素溶解，离心后取上清进行镍柱纯化，收集目的蛋白洗脱峰（图4）。将所得蛋白溶液进行梯度透析复性，最后溶于Tris溶液。将纯化复性后的目的蛋白进行Western印迹，结果显示目的蛋白与抗IL-15单抗有特异性结合（图5）。经HPLC测定，目的蛋白纯度达到95%以上（图6）。

2.4 rtIL-15融合蛋白疫苗免疫原性检测

为了验证rtIL-15的免疫原性，也同时验证氢氧化铝免疫佐剂的作用，分别用rtIL-15+佐剂、rtIL-15和生理盐水免疫BALB/c小鼠，免疫4次后取小鼠血清，用ELISA检测抗体滴度，结果如图7所示。抗血清中的多抗与IL-15有较好的结合活性；rtIL-15+佐剂组和rtIL-15组产生的抗IL-15抗体效价分别为1∶100 000和1∶1000。该结果说明rtIL-15融合蛋白疫苗确实具有免疫原性，并且氢氧化铝佐剂确实具有增强免疫效果的作用。

图2 重组表达质粒pQE-30-TT-IL-15的酶切鉴定

图3 重组菌的诱导表达（左）及超声波裂解（右）的SDS-PADE分析

图4 目的蛋白亲和层析纯化的SDA-PADE

3 讨论

图5 纯化的目的蛋白的Western印迹

图6 纯化的目的蛋白的HPLC分析

图7 ELISA检测rtIL-15的免疫原性

IL-15作为一种重要的前炎性细胞因子，具有促进炎症发展、刺激淋巴细胞滑膜细胞、促进骨质破坏等作用，与RA有密切关系，是近年来的研究热点。针对IL-15的单克隆抗体（AMG714）、IL-15受体γc亚单元的单抗及与IL-15受体特异性结合的IL-15融合蛋白（IL-15-Fcγ2a）都处于临床研究中[12-13]。但是，这些免疫治疗方法具有用药量大、病人经济负担重的缺陷。我们从激发患者自身免疫反应入手，拟发展一种具有治疗作用的IL-15疫苗，可以降低用药量，从而减轻病人身体和经济负担。但IL-15是一种自身蛋白，正常情况下机体对其存在免疫耐受。我们采取了融合外源性通用T辅助细胞表位的方法突破机体的免疫耐受，这种策略已成功地应用于TNFα、HER2、B7-H1等多种自体疫苗的研究中，并取得了不错的效果[14-16]。

我们将人IL-15基因克隆到带有His标签的原核表达载体pQE-30上，在大肠杆菌中诱导表达了重组人IL-15融合蛋白，但表达形式为包涵体沉淀，为蛋白纯化增加了难度。为了达到更好的镍柱亲和层析效果，我们尝试了不同的包涵体洗涤策略，分别在缓冲液加入不同浓度的尿素、盐酸胍、β-巯基乙醇、Triton X-100、脱氧胆酸钠进行摸索，最后发现含2 mol/L尿素、2%Triton X-100的洗涤液可以在不损失目的蛋白的情况下最大程度地去除杂蛋白。在8 mol/L尿素的强变性条件下，目的蛋白沉淀的二级结构充分打开，His标签得以完全暴露，经过一次亲和层析就能达到95%纯度的纯化效果。最后，经过缓慢的梯度透析，获得了可溶性的目的蛋白纯品。纯化后的rtIL-15融合蛋白疫苗在氢氧化铝佐剂存在的条件下免疫小鼠，诱导出高滴度的IL-15特异性抗体，说明rtIL-15融合蛋白疫苗具有很好的免疫原性。在后续研究中，我们将进一步系统检测rtIL-15疫苗在RA动物模型中的治疗效果及免疫机制，为其真正应用于临床打下基础。

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