中国南海石头鱼毒素NeoVTX的分离纯化、基因克隆及表达

张龙霄，刘珠果，郑兴，戴秋云

1.南华大学 药物药理研究所，湖南 衡阳 421001；2.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100071

石头鱼（Synanceia）属于辐鳍鱼纲（Actinoptery⁃gii）鲉形目（Scorpaeniformes）毒鲉科（Synanceiidae），生活在印度洋和太平洋的热带及亚热带浅水区域，是世界上毒性最强的鱼之一。其毒性装置包括13根背鳍棘、2根腹鳍棘、3根臀鳍棘，以及附着在背鳍棘上并分布于背鳍棘两侧的毒囊。当石头鱼受到攻击时，毒棘会刺入猎物体内，毒液从毒囊里挤出，沿着背鳍棘上的沟槽或沟管注入猎物体内，引起一系列中毒症状，如剧痛、水肿、肌肉麻痹、恶心、呕吐、腹泻、出汗、多涎（唾液分泌过多）、心律不齐、低血压、呼吸窘迫和惊厥等[1-3]。常见的石头鱼有玫瑰毒鲉（S.verrucosa）、粗毒鲉（S.horrida）和S.trachynis（目前尚无中文名称）等，中国海域的石头鱼为玫瑰毒鲉，主要分布于南海海域。

在石头鱼中发现的第一种毒素为Stonustoxin（SNTX），来自粗毒鲉，由α、β亚基组成，分别含有703与700个氨基酸残基，等电点为6.9，晶体结构呈四角形[4]。该毒素具有多种生物活性，包括抑制神经肌肉接头功能、增强血管通透性、强烈的溶血作用、促进血小板凝集、引发水肿等，对小鼠的半数致死量（LD50）为 17 ng/g（静脉注射）[5]。在S.trachynis中发现的Trachynilysin（TYL，目前还未测出全部序列），具有溶血活性、致死性及增加血管通透性的作用[6]。在玫瑰毒鲉中发现了Verrucotoxin（VTX）和Neover⁃rucotoxin（NeoVTX）。VTX为高分子量糖蛋白，由2个α（相对分子质量83×103）和2个β（相对分子质量78×103）亚基组成。β亚基与SNTX的β亚基具有相同的N端，且具有96%的序列同源性。VTX对小鼠的LD50为40 ng/g（静脉注射），还能裂解兔红细胞和降低大鼠动脉血压[7-8]。NeoVTX由α、β亚基组成，分别含有703与700个氨基酸残基，与SNTX的α、β亚基分别具有高达87%和95%的同源性。NeoVTX的β亚基与VTX的β亚基的同源性为90%。NeoVTX也具有溶血活性和致死性，对小鼠的LD50为47 ng/g（静脉注射）[9]。国内对石头鱼的研究极少，仅停留于病例报告。有关石头鱼毒素的表达目前仅有1篇报道。Farid等扩增出SNTX的α、β亚基的cDNA并连接到载体，分别导入大肠杆菌PR700进行表达，重组α、β亚基均能与天然SNTX的抗体结合[10]。

为研究石头鱼粗毒液毒性成分并阐明其基因序列，我们分离鉴定了中国南海石头鱼粗毒液蛋白质，钓取玫瑰毒鲉毒素NeoVTX的α和β亚基的cDNA序列，构建了稳定表达α亚基的大肠杆菌菌株。

1 材料和方法

1.1 材料

玫瑰毒鲉来自中国南海海域；大肠杆菌DH5α购自天根生化公司；大肠杆菌Rosetta感受态细胞购自北京全式金公司；pET-22b（+）载体购自Novagen公司；pMD18-T载体购自TaKaRa公司。其他主要试剂及来源：蛋白酶抑制剂Complete Ultra Tablet（罗氏诊断公司）；TRIzol（Invitrogen公司）；3'RACE及5'RACE试剂盒（TaKaRa公司）；Cre重组酶（近岸蛋白质公司）；氨苄西林（Amresco公司）；氯霉素（Merck公司）；酵母提取物、蛋白胨（Oxoid公司）；DNA凝胶回收试剂盒、2×Ex Taq Master Mix和广谱彩虹预染Marker（康为世纪公司）；DNA Marker（天根生化公司）；His标签蛋白纯化树脂（Ni-NTA Res⁃in）（海基生物公司）；BCA Protein Assay Kit（Thermo公司）。引物合成与基因测序由奥科鼎盛公司完成。

1.2 石头鱼粗毒液的提取

沿着石头鱼背鳍棘剪开皮肤和肌肉，将背鳍棘从脊柱上剪断，小心剥离毒棘末端的肌肉，使毒囊暴露，用注射器抽取毒囊中的粗毒液，加入Complete Ultra Tablet，-70℃保存备用。

1.3 石头鱼粗毒液的分离及鉴定

将粗毒液梯度稀释至1/8、1/16、1/32、1/64、1/128并进行SDS-PAGE，将主要条带切割，行液相色谱-质谱分析（LC-MS）。为明确粗毒液中的天然蛋白质，将粗毒液稀释至1/64，并进行天然凝胶电泳。

将粗毒液溶解于0.01 mol/L的PBS（pH7.0），4℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液进行分离［TSK Gel G2000 SWxl凝胶柱，流动相为0.5 mol/L NaCl-0.01mol/L PBS（pH7.0），流速0.5 mL/min］，收集组分并做SDS-PAGE。

1.4 毒腺组织RNA的提取

刮下毒棘上的毒腺组织，液氮冷冻后捣碎，用TRIzol试剂提取石头鱼毒腺组织RNA。

1.5 NeoVTX α和β亚基cDNA的克隆

根据文献[9]设计引物，按照试剂盒说明书，以毒腺RNA为模板进行3'RACE（α亚基扩增条件：94℃5 min，以94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 2.5 min循环35次，72℃ 5 min；β亚基扩增条件延伸时间为3.5 min，其余条件同α亚基）和5'RACE（α亚基扩增条件：94℃ 5 min，以 94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1.5 min循环35次，72℃ 5 min；β亚基扩增条件延伸时间为25 s，其余条件同α亚基）。反应结束后将目的片端连接pMD18-T载体，挑选PCR鉴定为阳性的克隆进行测序，分别获得石头鱼α和β亚基的3'及5'端序列。根据得到的序列，分别设计扩增α和β亚基全长cDNA的引物CA-F1（5'GGACGACTCACACAAC TCAG3'）、CA-R1（5'GGAGTCTTGGCATCAGTAAC 3'）、CB-F1（5'AGACTCCTACACAACTCAGC3'）和CB-R1（5'TAAGATACGTCCATGTACTGC3'）。 CAF1和CA-R1用于扩增α亚基，CB-F1和CB-R1用于扩增β亚基（扩增条件均为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2.5 min，循环35次；72℃ 5 min）。得到完整的α和β亚基cDNA后连接pMD18-T载体进行测序，最终获得α和β亚基cDNA序列。

1.6 α和β亚基cDNA序列的优化

α亚基13、332、534、557位，β亚基13、24、284位均存在CGA密码子，而大肠杆菌对CGA的识别率很低，故须对α、β亚基cDNA序列进行优化。根据CGA的位置，采用重新合成基因及PCR修正等方法，拼接得到了适于大肠杆菌表达的α和β亚基cDNA序列。

1.7 重组表达质粒pET-22b（+）-NeoVTXα及pET-22b（+）-NeoVTXβ的构建

为了将α和β的cDNA连入pET-22b表达载体，设计重组引物α-F（5'AAGAAGGAGATATACATAT GTCTTCAGATATCATGGTA3'）、α-R（5'GGTGGTG GTGGTGCTCGAGAAGTAATCTGACAGTTCC3'），以优化的α和β亚基cDNA为模板进行扩增（扩增条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2.5 min，循环35次；72℃ 5 min），得到用于重组的α和β亚基，按照Cre重组酶说明书，将用于重组的α和β亚基连入pET-22b表达载体，测序表明表达载体构建成功。

1.8 α、β亚基表达菌株的构建

将鉴定无误的重组表达质粒pET-22b（+）-NeoVTXα、pET-22b（+）-NeoVTXβ转化感受态大肠杆菌Rosetta，用含Amp和Cam的LB平板筛选，37℃过夜培养，挑取单菌落增菌后进行测序。

1.9 工程菌的诱导表达及检测

将工程菌接种于含Amp和Cam的LB液体培养基中，37℃振荡培养至D600nm约为0.6，加入诱导剂IPTG（同时设置不加诱导剂及使用空质粒转染宿主细胞的对照组），30℃连续培养5 h，收集菌体进行SDS-PAGE。将剩余的重组菌冰浴超声波裂解（400 W，超声 3 s，间隔 5 s，总时间为 10 min），5000 r/min离心20 min，收集上清液和沉淀（包涵体）进行SDS-PAGE，鉴定蛋白质的表达方式。

1.10 α亚基的大量表达和亲和层析纯化

将测序正确的表达pET-22b（+）-NeoVTXα的单菌落接种于10 mL培养基，过夜培养后，按菌液∶培养基为1∶100的比例接种到1 L培养基中，按照上述方法收集菌体，超声波裂解（400 W，超声3 s，间隔5 s，总时间为40 min），5000 r/min离心20 min，收集沉淀，用UNTA-0溶液溶解，0.45 μm滤膜过滤除去杂质，用带有组氨酸标签的镍-琼脂糖柱亲和层析纯化。NeoVTX α蛋白平衡液中的咪唑浓度为20 mmol/L，洗脱液中的咪唑浓度为500 mmol/L。SDSPAGE检测蛋白质纯度，并用BCA Protein Assay Kit测定蛋白质浓度。

2 结果

2.1 粗毒液的分离鉴定

粗毒液的SDS-PAGE、天然凝胶电泳及凝胶过滤HPLC见图1～3。粗毒液稀释至1/16后上样，得到6条蛋白质条带（标记为A、B、C、D、E、F），经质谱鉴定，确定 A 为 NeoVTX β，B 为 NeoVTX α（分别有99、69个肽段与β、α亚基序列匹配，基本覆盖了整个亚基序列），C、D、E、F为4个未知的蛋白质，其中，D、F与NeoVTX β有最高的匹配度（分别有41、19个肽段属于β），C与β微管蛋白、E与3-磷酸甘油醛脱氢酶的匹配度最高（分别有38、11个肽段属于β微管蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶）。粗毒液天然凝胶图（图2）中，G为完整的NeoVTX，H为NeoVTX解离的亚基。凝胶过滤HPLC（图3）与电泳图类似，NeoVTX在上清液中含量最高，其他组分丰度较低。

2.2 α、β亚基cDNA序列的克隆

经过3'RACE、5'RACE和全cDNA序列的扩增，得到了α和β亚基cDNA全序列。将cDNA序列连入pMD18-T载体，测序并翻译，得到如下蛋白质序列。

α亚基序列:

MSSDIMVMPALGRPFTLGMLYDTRREKLIPGFSLFGDETLQQYQ SSNTQRSSEFKIVASDSTEPKSSAMDIEASLGVSFLGGLVEVGG SAKYLNNTKKYQNQSRVTLKYKATTIYKQFTAPPGTVKVQETVI TQRGLATHVVTGILYGANAFFVFDSDKVEDTNLQDIQGKMEAVI KKIPTTSIEGSASVQLTDEEKSLASNLSCKFHGDFLLESLPTTF EDAVTTYQTLPTLLGEDGASAVPMKVWLVPLKKFFSKAKLLTQE ITVSKVRRIHTTLEELYKLKRRANEAMDDKLVQQIPLIHDKISN FHQIFQDYMLTVQKKIAEKLPLVRAGTESEQSLQKIIDDRAKSP FSNENVSTRLEVIEREIAVLKSCAGMVEGTQAKFVSNQTELDRE VLAEDVKHALCFVFTSVERNDPYLKVLSDYLEPPDSKDGKEAVP STEDKWCFSTRVVLKMKQRAQTFCDHVNDFEKSRNVGFFVTALE NGKFQGASIYHYKEGSLATQDFTFPRMPFVQGYKKRSDLLWYAC DLTFDRNTINIWVSLSDNDTFAASEHGKRQNYPKHPERFLCYNQ VLCNEGLTGKHYWEVEWNGYVDVGVAYISISRKEDNWVSAIGHN TCSWVFSSIPRAGYVERYNQRQYYVTVPTPGFKQLGVFLNWPDG SLSFYAVSSDEVHHLHTFKTKFTEPVYPAFCLGYRFDHGTVRLL

β亚基序列：

图1 粗毒液的SDS-PAGE

图2 粗毒液的天然凝胶电泳

图3 粗毒液的凝胶过滤分离

MPSDILVVAALGRPFTLGMLYDARNDKLIPGFTLWEDEVIEEST VENSQPSSAFEIIASDSIDDKSSLMDIEASLKASFLGGLVEVGG SAKYLNNQKKFKNQSRVTLQYKATTNFKQLMTNLGTKHVEYTEL FENIQATHVVIGILYGANAFFVFDSNKVDSTNVQEIQGQMEAVI KKIPSVEISGKASVQLTSEETDITNSFSCEFHGDFFLTSNPTTF EDAVKTYQQLPQMMGKDNAVPMTVWLVPMVNFYSEAPQLMADSS TPILRKVRNTLEAIVQVQMRCNDALDDPTVNLFTEVQRKLSDFQ IICDDHMSKLQATIAKKLFAIRSGDEDESALVNLFEENLQSPFN IESLNMWMEFEEREINVLKSCMDILTKAKPKVIFNQGVFFKELY DSKVKHGLCYVFTNVTKNDDFLTVLNDFLDSPQSRPKKLRPSPK DYWYSYDDIPEMMREKAHLFRNLAKEMNNRCVHFFVTAINNPKQ EGAGIHYYRESIQIIHEFTKPHMPDVETIKDRRELQWYDCELTL DTETAHQVLTLSEGNKKAVSGSTKSPADHFEKFSHFQQVMCTKG LSGRHYWELEWSGHVSAGVTYKGISRKTSTPDSSLGKNQKSWVF EYTKKSGYQQIHNGKNARVTVSSIGFKQLGVYLDWPAGTLSFYM VNKAWVTHLHTFHTKFYEAVYPAFLIGDAQQKVNGQIKLL

将2个亚基的序列与文献[9]中α、β的序列进行BLAST比对，同源性均高达99%。

2.3 工程菌测序

对α、β亚基cDNA序列进行优化后设计重组引物，扩增得到可以使用Cre重组酶进行重组连接的cDNA序列，分别连入pET-22b（+）载体，测序，得到重组表达载体 pET-22b（+）-NeoVTXα、pET-22b（+）-NeoVTXβ，分别转化大肠杆菌Rosetta后，挑取菌落进行测序，结果均正确，表明得到含有目的基因的工程菌。

2.4 工程菌表达蛋白质的鉴定

将pET-22b（+）-NeoVTXα工程菌用IPTG诱导后，收集菌体并裂解，收集上清液与沉淀进行SDSPAGE（对照组也依此进行）。工程菌诱导后，较诱导前有明显增加的蛋白条带，相对分子质量约75×103，为构建的工程菌诱导表达后的外源蛋白。重组α亚基几乎都分布于超声波裂解后的菌体沉淀中，以包涵体的形式存在，上清液中含量很少（图4）。β亚基较诱导前无明显增加。

2.5 α亚基的表达及纯化

经1 L发酵体系培养，收集菌体，超声波裂解、离心并溶解沉淀，Ni-NTA纯化带6×His标签的α亚基，得到纯度大于95%的重组蛋白0.45 mg（图5）。

3 讨论

我们除了对石头鱼粗毒液中丰度高的NeoVTX进行研究外，对丰度较低的蛋白质也进行了探讨。经过质谱测序，推测上述D、F为分子较小的毒素或NeoVTX β的降解片段，C、E为β微管蛋白的结构蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶。值得注意的是，有些分子较小的蛋白质或多肽也具有毒性，如在奥氏江魟（Potamotrygon orbignyi）中发现的 Orpotrin 和 Por⁃flan。Orpotrin仅有9个氨基酸残基，仍然具有强烈的收缩血管的作用；Porflan含有18个氨基酸残基，可与细胞膜磷脂相互作用，与江魟毒素的诱导过敏反应有紧密关系[11-12]。D和F是否在石头鱼毒性中扮演重要的角色有待进一步研究。

图4 α亚基的表达鉴定

图5 纯化的α亚基的凝胶电泳

本研究中的南海石头鱼NeoVTX的α、β亚基与在日本冲绳海域捕捞的石头鱼NeoVTX的α、β亚基的同源性均为99%，说明两者的亲缘性很高。

经密码子优化后，α亚基在pET-22b（+）载体中可有效表达，β亚基经密码子优化后表达仍较困难，后改用pET-24a（+）和pET-28a（+）载体表达，表达量仍较低，目前正在尝试其他表达体系。

总之，我们获得了中国南海石头鱼粗毒液中的毒性蛋白质NeoVTX，克隆了其cDNA序列，构建了稳定表达NeoVTX α亚基的大肠杆菌菌株，为制备中国石头鱼抗毒素奠定了基础。

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