四氢嘧啶羟化酶的研究进展

张庆，王青青，鞠建松，徐书景

河北师范大学 生命科学学院，河北 石家庄 050024

近年来，四氢嘧啶（ectoine，E）及其衍生物5-羟化四氢嘧啶（hydroxyectoine，HE）在微生物细胞中作为渗透相溶性物质已被广泛研究，它们不仅具有与其他相容性物质（如甜菜碱、糖、氨基酸及其衍生物、多元醇等）相同的渗透调节作用，还具有在冷冻、高温、干燥及氧自由基环境中保护细胞膜、维持蛋白结构稳定的性能[1-2]。虽然四氢嘧啶和5-羟化四氢嘧啶在结构上密切相关，作用方面也有很多相似之处，但最近的研究显示5-羟化四氢嘧啶对蛋白的保护作用要优于四氢嘧啶和其他相溶性物质[3]。

目前5-羟化四氢嘧啶已被广泛应用到医药、生物制造、化工等行业[4]。有研究发现，5-羟化四氢嘧啶不仅可以加入药物中用于神经系统疾病的治疗，也可作为化疗时健康细胞的保护剂[5]。Harishchan⁃dra等发现，5-羟化四氢嘧啶还具有增强人工肺表面活性剂的作用[6]。此外，5-羟化四氢嘧啶还能提高双链DNA的解链温度，可以作为聚合酶链式反应（PCR）的增强剂[7]。

四氢嘧啶羟化酶（ectoine hydroxylase，EctD）主要负责将四氢嘧啶羟基化，转化为5-羟化四氢嘧啶，属于Fe2+与2-酮戊二酸依赖性的双加氧酶超家族（EC 1.14.11）[8-9]。自从发现EctD以来，国内外学者对EctD产生菌做了广泛研究。李岩等从极端耐盐放线菌中克隆获得5-羟基四氢嘧啶合成相关基因ectABCD，并分析了这些基因对菌株在高盐胁迫中的作用[10]；Reuter等从需盐枝芽孢杆菌（Virgibacil⁃lus salexigens）中克隆获得目的基因ectD，并对其蛋白晶体结构和催化机理进行了解析[11]。我们将就EctD的基因来源、功能、结构及活性中心等方面的研究进展进行综合分析。

1 四氢嘧啶羟化酶的来源

拥有ectD基因的微生物在生理、生活方式和栖息地分类上相对多样化，它们中有的来自病原菌，如脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus）和波氏杆菌属（Bordetella)的多个菌株；有的来自在抗生素生产方面具有重要作用的微生物，如天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）和灰色链霉菌（S.griseus）；有的是生长在极低或极高温度环境中的细菌，如嗜热芽孢杆菌（Geobacillus sp.Y412MC10）和嗜冷鞘脂单胞菌（Sphingopyxis alaskensis），以及生长在极端pH环境中的细菌，如欧氏碱湖生菌（Alkalilimnicola ehrlichei）；大部分拥有ectD基因的微生物生长在高盐或海洋环境中，如海洋细菌泊库岛食烷菌（Alca⁃nivorax borkumensis SK2）[11]。

Bursy等通过氨基酸序列比对检索发现，有46株革兰阳性或阴性菌的EctD与需盐枝芽孢杆菌的EctD的氨基酸同源性高达61%～73%，其中ectD基因位于ectABC基因簇下游的有30种，而剩余的16株中ectD基因并不与ectABC基因相连[9]。ectD基因片段的大小随菌株来源不同而不等，一般约为1 kb，如来自需盐色盐杆菌（Chromohalobacter salexigens）的 ectD-1基因为 996 bp（GenBank：ABE60347.1），ectD-2基因为 942 bp（GenBank：ABE57904.1），而来源于需盐枝芽孢杆菌的ectD基因为900 bp（Gen⁃Bank：AAY29689.1）[11]。尽管不同来源的EctD的氨基酸序列同源性有所不同，但它们的保守位点，如与2-酮戊二酸及Fe2+的结合位点基本相同（图1），说明ectD基因在进化上是相对保守的[1-11]。

序列同源性比对检索发现，ectD与脯氨酸羟化酶基因、人类植烷酸-辅酶A羟化酶（phytanoyl-CoA hydroxylase，PhyH）基因具有较高的同源性，同属于Fe2+与2-酮戊二酸依赖性的双加氧酶超家族，都存在结合Fe2+的保守2-His-1-羧酸酯面三联体[9]。不同来源的EctD与指孢囊菌RH1中L-脯氨酸-4-羟化酶（GenBank：D78338.1）的氨基酸序列同源性为26%～32%[12]。由于以上原因，ectD基因常被误认为脯氨酸羟化酶基因或植烷酸-辅酶A羟化酶基因[2]。

2 四氢嘧啶羟化酶的催化反应机理

EctD属于Fe2+与2-酮戊二酸依赖型双加氧酶，该家族的酶普遍存在于原核和真核微生物中，能催化多种氧化反应，包括环化反应、环碎裂、C-C键断裂、降低氧饱和度、卤化及羟化反应等[13-14]。在四氢嘧啶羟基化反应中，共底物2-酮戊二酸脱去羧基释放一个CO2分子从而形成琥珀酸，同时，氧分子中的一个氧原子被纳入琥珀酸盐，而另一个氧原子形成羟基插入四氢嘧啶从而形成5-羟化四氢嘧啶[9]。

3 四氢嘧啶羟化酶的活性检测方法

目前EctD的活性检测方法主要为高效液相色谱法（HPLC）[15]。四氢嘧啶及羟化四氢嘧啶的检测以乙腈/水（80/20，V/V）为流动相，流速为1.0 mL/min，在210 nm处检测吸收峰[16]。底物四氢嘧啶及产物羟化四氢嘧啶可以采用C18柱通过紫外检测器直接检测[17]，也可以通过Fmoc-Cl柱前衍生，采用NH2柱通过荧光检测器检测[15]，根据底物和产物的峰面积计算EctD的催化效率[9]。

虽然EctD的来源很广，但其催化条件基本相似，催化过程中都需要氧气（剧烈振荡）、FeSO4、α-酮戊二酸及L-抗坏血酸。Bursy等发现催化反应中仅需要低浓度的FeSO4和抗坏血酸，FeSO4浓度超过1 mmol/L会对EctD的活性产生抑制作用，同样，5 mmol/L抗坏血酸对EctD的活性抑制作用达70%，而加入过氧化氢酶则有利于提高酶催化活性，加入1.3 kU的过氧化氢酶可使酶蛋白的催化效率提高5倍[9]。Bursy等对来自天蓝色链霉菌（S.coelicolor）A3（2）和需盐枝芽孢杆菌的EctD的酶学特性进行了表征，分析表明二者的催化条件基本相似，对底物四氢嘧啶和2-酮戊二酸的亲和常数Km也基本相当[8]。

将四氢嘧啶的2种衍生物，五元环化合物［（RS）-4，5-dihydro-2-methyl-imidazole-4-carbox⁃ylic acid］及七元环化合物homoectoine［（S）-4，5，6，7-tetrahydro-2-methyl-1H-（1，3）-diazepine-4-carboxylic acid］作为底物，经检测发现并没有得到其羟化产物，说明EctD具有高度的底物专一性，仅对四氢嘧啶（六元环化合物）具有催化活性[9]。

图1 四氢嘧啶羟化酶与脯氨酸羟化酶的同源序列比对（部分）

4 四氢嘧啶羟化酶的空间结构

虽然EctD广泛存在于各种革兰阴性和阳性细菌中，其产物5-羟化四氢嘧啶作为相溶性物质也被广泛研究，但有关EctD空间结构的报道却很少。目前仅有来自需盐枝芽孢杆菌的EctD蛋白结构得到解析（PDB no.3EMR）[11]。从解析的结构来看，EctD蛋白以单体形式存在，与其他非血红素铁（Ⅱ）和2-酮戊二酸依赖性双加氧酶的成员一样，其蛋白结构的核心部分由双链β-螺旋和一些稳定的α-螺旋组成。它由链β-Ⅰ、β-Ⅱ、β-Ⅲ、β-Ⅳ、β-Ⅴ、β-Ⅵ、β-Ⅶ和β-Ⅷ组成，其中β-Ⅱ、β-Ⅳ、β-Ⅴ和β-Ⅶ形成曲折的片段，组成所谓的短链，而主要片段则由β-I、β-Ⅲ、β-Ⅵ和β-Ⅷ组成。EctD中的主要片段两侧的延伸由反平行链β-2、β-3和β-4组成。

4.1 Fe2+结合位点

非铁红素和2-酮戊二酸依赖性的双加氧酶家族的酶促功能主要取决于高度活泼的铁离子。在需盐枝芽孢杆菌EctD的活性中心，氨基酸残基His146、Asp148和His248的功能基团（2个咪唑基团和1个羧基基团）与Fe2+结合形成所谓的2-His-1-羧酸酯面三联体[11-18]。Widderich等将这些位点分别突变为Ala后，不仅导致突变体蛋白H146A、D148A和H248A完全丧失了酶学活性，而且在突变体蛋白中也不再含有铁离子，与之相反的是，每摩尔野生型EctD中含有0.9 mol的铁离子，这些结果证明氨基酸残基His146、Asp148和His248是酶蛋白结合铁离子及酶活性所必需的[18]。

4.2 2-酮戊二酸结合位点

在所有含非还原性亚铁离子和2-酮戊二酸依赖型双加氧酶中，共底物2-酮戊二酸结合于酶蛋白活性中心底部，并通过其1-羧基基团和2-氧代基团参与协调亚铁离子与酶的结合，其5-羧基基团则通过与精氨酸或赖氨酸的侧链碱性基团形成的盐桥及与氨基酸残基的羟基形成氢键而稳定结合[18-19]。

由于至今还没有得到EctD与2-酮戊二酸的复合物晶体，2-酮戊二酸与EctD的结合位点只能通过比较EctD的配体结合口袋及其他双加氧酶的结构来推测。McDonough等对与EctD最接近的PhyH蛋白结构研究发现，Ser266的羟基基团与2-酮戊二酸相互作用[20]；通过对71个EctD类蛋白序列比对，Ruter等发现需盐枝芽孢杆菌来源的EctD中Ser250位点与PhyH中Ser266位点相对应，该位点严格保守，位于与亚铁离子螯合的His248之后，Ruter等推测EctD中Ser250的醇羟基可能与2-酮戊二酸的5-羧基基团相互作用[11]。随后，Widderich等通过对185个EctD类蛋白序列进行比对及PhyHD1A（PDB no.2OPW）和2-酮戊二酸复合物晶体结构信息，发现EctD中氨基酸位点Arg259、Ser250和Phe143与PhyHD1A中2-酮戊二酸的结合位点相对应，将这些位点分别突变为Ala后均导致酶蛋白活性丧失，说明EctD中2-酮戊二酸结合位点由 Arg259、Ser250和 Phe143构成[18]。此外，Wid⁃derich等发现，除了上述与2-酮戊二酸结合的3个位点外，Arg131也和2-酮戊二酸分子存在相互作用，其侧链与Phe95及Asn133的侧链形成阳离子-π相互作用，从而使其稳定存在于结合配体的孔穴之中，起到了维持EctD结构稳定的作用，一旦失去了这个相互作用就会导致EctD活性中心更加开放，导致酶蛋白不能结合底物。Widderich等将上述3个氨基酸位点分别突变为Ala后，所得突变体蛋白完全丧失了活性，证明这些位点和2-酮戊二酸之间存在相互作用[18]。因此，可以说EctD中2-酮戊二酸的结合位点由Arg259、Ser250、Phe143、Arg131、Asn133和 Phe95构成。

4.3 四氢嘧啶结合位点

同样，由于至今还没有得到EctD与底物（四氢嘧啶）或产物（5-羟化四氢嘧啶）的复合物晶体，底物和EctD的结合位点尚无法确定[11]。Widderich等通过分子动力学模拟技术（molecular dynamics simula⁃tions）对需盐枝芽孢杆菌来源的EctD分析发现，四氢嘧啶位于由氨基酸残基 Gln129、Trp152、Ser165、Phe242和Phe263组成的口袋中，其与各氨基酸残基侧链间的距离为5～6 Å；此外，四氢嘧啶的甲基基团指向位于口袋底部的Ser130的主链（甲基基团与Ser130的Cα间的距离小于5 Å），其羧基基团和Ser165的侧链形成氢键（二者间距离小于3.2 Å），并导致四氢嘧啶分子的脒基和残基Gln129侧链以氢键结合；而从185个EctD类蛋白序列比对结果可以看出，上述6个氨基酸位点均高度保守。因此，Widderich等推测这些氨基酸残基可能是酶蛋白EctD的底物结合位点[18]。

为了证实四氢嘧啶结合位点预测的结果，Widd⁃erich等构建了一系列定点突变体：将氨基酸残基Gln129、Trp152、Phe242和 Phe263分别突变为 Ala，所获得的突变体酶蛋白的活性均完全丧失，而Ser165突变为Ala仅使酶蛋白的活性功能受到较大程度的限制；进一步将Trp152突变为Phe或Tyr后，突变体同样失去了蛋白活性，这个结果和通过分子动力学模拟所构建的模型相一致，说明四氢嘧啶分子与Trp152侧链上的苯环相互作用，氨基酸置换使该位点侧链失去苯环后导致突变体蛋白无法和四氢嘧啶结合，从而使蛋白丧失活性。同样，将Phe242和Phe263突变为Tyr后导致突变体酶蛋白活性大幅下降，而突变为Trp后则活性完全丧失，说明四氢嘧啶结合位点不能进行较大的结构上的修改，尤其是插入含有大体积侧链的色氨酸残基。Widderich等还对一些侧链远离酶蛋白催化中心或伸向cupin桶状结构但并不与配体相互作用的氨基酸残基进行突变，如位于柔性loop区域的Pro198和Ser205等，这些位点突变后突变体酶蛋白仍然保持活性。由此可以说明氨基酸残基Gln129、Ser130、Ser165、Trp152、Phe242及 Phe263是与底物四氢嘧啶相结合的关键位点[18]。

5 展望

EctD的催化产物5-羟化四氢嘧啶作为相容性物质已受到广泛关注，它存在于很多细菌中，提高细胞内的水活度，维持细胞内外渗透压的平衡，保证细胞正常的代谢活动[16]。Rodríguez-Moya等将需盐色盐杆菌四氢嘧啶合成基因簇ectABC和ectD串联表达，提高了5-羟化四氢嘧啶的生成量，细胞对许多环境刺激因素（高盐、温度、铁离子、外部渗透剂、DNA促旋酶抑制剂萘啶酸等）的耐受性也得到了提高[21]。目前，利用EctD转化生成5-羟化四氢嘧啶也受到科研工作者的重视。Eilert等将伸长盐单胞菌（Halomonas elongata）中5-羟化四氢嘧啶合成基因簇ectA、ectB、ectC和ectD插入汉逊酵母（Hansenula polymorpha）基因组后，所构建工程菌株的5-羟化四氢嘧啶转化率接近100%，发酵液中产物达到2.8 g/L[22]。可以看出，目前在EctD的开发利用方面得到了比较充分的研究。不过，有关该酶的空间结构及催化机理方面的研究还比较少，迄今仅有来自需盐枝芽孢杆菌的EctD晶体结构和催化机理得到了解析和研究，这方面的工作还有待进一步完善。此外，可通过转基因技术将ectD基因插入工程菌株或转基因植物中，以提高工程菌株和转基因植物对高盐、高温、干燥、冰冻等环境刺激因素的耐受性。

EctD和脯氨酸羟化酶都属于Fe2+、2-酮戊二酸依赖型双加氧酶超家族，相互间序列同源性较高，与底物及配体的结合位点高度保守，Widderich等将脯氨酸羟化酶归类于EctD类酶蛋白[18]，因此，我们推测二者或许具有相似的催化功能。由于羟脯氨酸可作为各种软组织疾病的药物，还可加快伤口愈合，治疗各种皮肤疾病，它还是合成多种药物的原料，如第三代抗生素，抗肿瘤、抗高血压及新型胃药等，因此，羟脯氨酸的生物合成具有广阔的发展前景[23-24]。但是，由于当前采用的脯氨酸羟化酶主要来自指囊孢菌，该酶基因中的GC含量过高（73.9%），影响酶蛋白的可溶性表达，且该酶的催化活性低，反应时间长，产率较低，不利于工业化生产[23]。本实验室从盐湖样品中克隆获得了一个ectD基因，所编码酶蛋白以可溶性形式大量表达，活性检测发现该酶具有微弱的羟脯氨酸转化能力；参照已解析的EctD和脯氨酸羟化酶三维结构信息，分析酶蛋白的活性中心及配体结合位点，通过基因工程技术合理改造EctD，以获得可溶性好且对脯氨酸催化效率高的理想酶蛋白。

[1]Garcia-Estepa R,Argandona M,Reina-Bueno M,et al.The ectD gene,which is involved in the synthesis of the compati⁃ble solute hydroxyectoine,is essential for thermoprotection of the halophilic bacterium Chromohalobacter salexigens[J].J Bac⁃teriol,2006,188(11):3774-3784.

[2]Smiatek J,Harishchandra R K,Galla H J,et al.Low concen⁃trated hydroxyectoine solutions in presence of DPPC lipid bi⁃layers:a computer simulation study[J].Biophys Chem,2013,180-181:102-109.

[3]Van-Thuoc D,Hashim S O,Hatti-Kaul R,et al.Ectoine-me⁃diated protection of enzyme from the effect of pH and temper⁃ature stress:a study using Bacillus halodurans xylanase as a model[J].Appl Microbiol Biotechnol,2013,97(14):6271-6278.

[4]朱道辰,刘杏荣.相容性溶质四氢嘧啶及其羟基化衍生物的研究进展[J].中国生物工程杂志,2011,31(2):95-101.

[5]Kanapathipillai M,Lentzen G,Sierks M,et al.Ectoine and hydroxyectoine inhibitaggregation and neurotoxicity ofAl⁃zheimer's beta-amyloid[J].FEBS Lett,2005,579(21):4775-4780.

[6]Harishchandra R K,Sachan A K,Kerth A,et al.Compatible solutes:ectoine and hydroxyectoine improve functional nano⁃structures in artificial lung surfactants[J].Biochim Biophys Ac⁃ta,2011,1808(12):2830-2840.

[7]Schnoor M,Voss P,Cullen P,et al.Characterization of the synthetic compatible solute homoectoine as a potent PCR en⁃hancer[J].Biophys Res Commun,2004,322(3):867-872.

[8]Bursy J,Kuhlmann A U,Pittelkow M,et al.Synthesis and uptake of the compatible solutes ectoine and 5-hydroxyec⁃toinebyStreptomycescoelicolorA3(2)in responsetosalt and heatstresses[J].ApplEnviron Microbiol,2008,74(23):7286-7296.

[9]Bursy J,Pierik A J,Pica N,et al.Osmotically induced syn⁃thesis of the compatible solute hydroxyectoine is mediated by an evolutionarily conserved ectoine hydroxylase[J].J Biol Chem,2007,282(43):31147-31155.

[10]李岩,董雷,王磊,等.极端耐盐放线菌白色普氏菌YIM90005T四氢嘧啶及5-羟基四氢嘧啶合成相关基因的克隆[J].微生物学报,2011,51(5):603-608.

[11]Reuter K,Pittelkow M,Bursy J,et al.Synthesis of 5-hy⁃droxyectoine from ectoine:crystal structure of the non-heme iron(II)and 2-oxoglutarate-dependentdioxygenase EctD[J].PloS One,2010,5(5):e10647.

[12]Shibasaki T,Mori H,Chiba S,et al.Microbial proline 4-hy⁃droxylase screening and gene cloning[J].Appl Environ Microbi⁃ol,1999,65(9):4028-4031.

[13]Clifton I J,McDonough M A,Ehrismann D,et al.Structural studies on 2-oxoglutarate oxygenases and related doublestranded beta-helix fold proteins[J].J Inorg Biochem,2006,100(4):644-669.

[14]Purpero V,Moran G R.The diverse and pervasive chemis⁃tries of the alpha-keto acid dependent enzymes[J].J Biol In⁃org Chem,2007,12(5):587-601.

[15]Jörg Kunte H,Galinski E A,Trüper H G.A modified FMOC-method for the detection of amino acid-type osmolytes and tetrahydropyrimidines(ectoines)[J].J Microbiol Methods,1993,17(2):129-136.

[16]何健,黄星,顾立峰,等.盐单胞菌属BYS-1四氢嘧啶合成基因ectABC克隆及其盐激表达[J].微生物学报,2006,46(1):28-32.

[17]Wei Y H,Yuan F W,Chen W C,et al.Production and char⁃acterization ofectoine by Marinococcus sp.ECT1 isolated from a high-salinity environment[J].J Biosci Bioeng,2011,111(3):336-342.

[18]Widderich N,Pittelkow M,Hoppner A,et al.Molecular dy⁃namics simulations and structure-guided mutagenesis provide insight into the architecture of the catalytic core of the ec⁃toine hydroxylase[J].J Mol Biol,2014,426(3):586-600.

[19]Aik W,McDonough M A,Thalhammer A,et al.Role of the jelly-roll fold in substrate binding by 2-oxoglutarate oxygenas⁃es[J].Curr Opin Struct Biol,2012,22(6):691-700.

[20]McDonough M A,Kavanagh K L,Butler D,et al.Structure of human phytanoyl-CoA 2-hydroxylase identifies molecular mechanisms of Refsum disease[J].J Biol Chem,2005,280(49):41101-41110.

[21]Rodriguez-Moya J,Argandona M,Iglesias-Guerra F,et al.Temperature- and salinity-decoupled overproduction ofhy⁃droxyectoine by Chromohalobacter salexigens[J].Appl Environ Microbiol,2013,79(3):1018-1023.

[22]Eilert E,Kranz A,Hollenberg C P,et al.Synthesis and re⁃lease of the bacterial compatible solute 5-hydroxyectoine in Hansenula polymorpha[J].J Biotechnol,2013,167(2):85-93.

[23]Klein C,Hüttel W.A simple procedure for selective hydroxyl⁃ation of L-proline and L-pipecolic acid with recombinantly expressed proline hydroxylases[J].Adv Synthesis Catalysis,2011,353(8):1375-1383.

[24]Shibasaki T,Mori H,Ozaki A.Enzymatic production of trans-4-hydroxy-L-proline by regio- and stereospecific hydroxyl⁃ation of L-proline[J].Biosci Biotechnol Biochem,2000,64(4):746-750.