山葡萄黄烷酮3—羟化酶VamF3H基因及其克隆

李娟　曹芳芳　权哲　刘海峰

摘要：采用RT-PCR与RACE技术相结合的方法，从山葡萄果皮中克隆到黄烷酮3-羟化酶（F3H）基因的cDNA全长序列。该基因全长1 398 bp，包含1 092 bp的完整开放阅读框，编码363个氨基酸，相对分子质量为40.81 ku，等电点（PI）值为5.37。二级结构预测表明，随机卷曲是VamF3H蛋白最大量的结构元件，不具有信号肽，属于不稳定亲水蛋白。氨基酸序列与欧亚种葡萄（FQ389950）、圆叶葡萄（KF040970）、美国蔓藤（JX087441）等的F3H类基因同源性较高，相似性分别为99%、99%、96%。

关键词：山葡萄；cDNA克隆；黄烷酮3-羟化酶

中图分类号： S663.101 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）10-0036-05

黄烷酮3-羟化酶（flavanone 3-hydroxylase，F3H）是花色素合成途径中的结构基因，是花青素生物合成途径中的关键酶[1]。F3H属于依赖2-酮戊二酸的双加氧酶，反应需要2-酮戊二酸、分子氧、铁、抗坏血酸[2]。其作用为催化柚皮素C3位羟基化，生成二氢山奈酚（dihydrokaempferol，DHK），而DHK是黄酮和异黄酮合成的重要中间产物；因此，F3H调控着黄酮与花青素苷产物的合成，是整个黄酮类化合物代谢途径的中枢位点[3]。有报道指出F3H与花青苷合成关系密切[4]，然而此方面的研究尚较少。Holton等发现F3H对黄烷酮、儿茶酸、原花青素、花青素代谢影响较大，是该代谢途径的关键酶[3]。Lepiniec等研究证实，由F3H和F3′H催化生成的黄烷酮醇在DFR的催化作用下能够合成无色花青素[5]。F3H的活性最初在紫罗兰花中被检测到[6]。Martin等利用鉴别筛选与基因图谱技术首次从金鱼草中分离克隆到F3H基因[7]。研究表明，F3H基因在矮牵牛等植物中是独立表达的，而大多数情况下，F3H与其上游的CHS、CHI基因，以及下游的DFR基因协同表达[8]。在大多数物种中，F3H基因仅以单拷贝形式存在[9-11]。

山葡萄别称野葡萄，最初发现于我国东北和俄罗斯远东地区，在我国主要分布于吉林省长白山、黑龙江省完达山、小兴安岭、辽宁省北部等地[12]。山葡萄是我国重要的野生果树资源，具有极强的抗寒性，是东北地区酿造葡萄酒的主要原料[13]，其浆果含有大量花色苷。目前，分子生物技术已广泛应用于葡萄遗传育种的各个领域，加速了葡萄遗传学图谱、基因的克隆表达、新基因的分离鉴定等研究的进展[14]。F3H基因已在玉米、矮牵牛花、水母雪莲等很多植物中克隆得到并且定性[15]。在拟南芥、茄子、苜蓿、葡萄、苹果、柑橘、梨、康乃馨、翠菊、日本牵牛等植物中均克隆到了F3H基因，但未见山葡萄中F3H基因的相关报道。本研究采用RT-PCR和RACE技术相结合的方法克隆F3H基因，获得全长序列，并进行生物信息学分析，旨在为阐明山葡萄花色苷的生物合成及调控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供试山葡萄品种为双丰（Vitis amurensis Shuang Feng），采自国家山葡萄种质资源圃。采摘无病虫害、饱满的成熟期果粒，立即置于液氮中冷冻，并于-80 ℃冰箱保存，取其果皮作为供试材料。

1.1.2 菌株、酶、生化试剂 Tris-HCl、CTAB、EDTA、无水LiCl、β-巯基乙醇、DEPC水、AMP、IPTG、X-gal均为AITiresco分装试剂；大肠杆菌DH5α、pMD19-T载体、Taq酶、Marker DL 2 000均购自TaKaRa公司；胶回收试剂盒购自OMEGA公司；反转录酶SuPerscriptll购自invitrogen公司；SMARTTM RACE试剂盒购自Clonteeh公司；其他试剂均为国产分析纯。引物由英俊生物技术有限公司合成，DNA测序由上海生工生物公司完成。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 登录NCBI网站，根据GenBank中已登陆的F3H基因的核苷酸序列和氨基酸序列，通过多序列比对确定其共有的保守区，利用Primer 6.0软件设计1对特异引物用来扩增目的片段。上游引物F1：5′-TGTCTGGTGGCAAGAAAGGC-3′；下游引物F2：5′-CGAGGGTGAGGTCTGGCTGT-3′。

以该引物扩增出的序列设计5′RACE和3′RACE引物，分别为：F3H-a：5′-AGCGTCCTTGTCCAAATCCA-3′；F3H-s：5′-CGTTTCCAGCCATCTTCA-3′。

1.2.2 山葡萄果皮总RNA的提取及cDNA的合成 采用改良的CTAB[16]法提取山葡萄果皮中的总RNA。采用紫外分光光度计测定其230、260、280 nm处的吸光度及总RNA浓度，用1%TAE检测RNA的完整性。

按照Invitrogen公司的SuperScriptⅡ反转录酶试剂盒说明书，以Oligo（dT）20为引物、总RNA为模板进行逆转录反应，合成cDNA的第1条链。

1.2.3 PCR扩增目的基因片段 以山葡萄cDNA第1链为模板，用引物F1、F2进行PCR扩增。50 μL反应体系包括：2.0 μL cDNA、5.0 μL 10×Ex Taq Buffer（Me2+ free）、0.4 μL Ex Taq（5 U/μL）、36.6 μL ddH2O、F1和F2引物各1.0 μL。反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；最后72 ℃延伸7 min，于4 ℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并回收纯化目的片段。

1.2.4 5′RACE和3′RACE法获得基因片段 参照SMARTTM RACE试剂盒说明书，以逆转录分别合成的5′-RACE-Ready-cDNA和3′-RACE-Ready-cDNA为模板，以F3H-a、F3H-s分别同UPM为引物，进行5′RACE、3′RACE扩增以获得5′端片段、3′端片段。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，共35个循环；最后72 ℃延伸7 min，于4 ℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测以确定条带。

1.2.5 目的片段的回收和连接 按照胶回收试剂盒说明书对PCR产物的DNA片段进行回收、连接、转化。将回收的DNA片段与pMD-18载体连接，于16 ℃连接3 h。反应体系为pMD-18载体0.5 μL、DNA片段4.5 μL、SolutionⅠ5.0 μL。

1.2.6 转化 将DH5α感受态细胞解冻后，取50 μL加入10 μL连接产物，冰浴30 min；取出后热激90 s，并置于冰上2～3 min；加入预热的LB液体培养基300 μL，于37 ℃、190 r/min培养1 h；取适量菌液涂布于含有AMP、X-Gal、IPTG的LB固体培养基平板上，于37 ℃培养箱中倒置培养过夜。次日，挑白色单克隆置于37 ℃摇床中，200 r/min培养12 h。随后进行菌液PCR检测，将成功克隆的菌样测序。

1.3 VamF3H基因序列及其编码蛋白质的生物信息学分析

利用DNAstar软件查找VamF3H基因的开放阅读框（ORF）并推导其氨基酸序列；利用NCBI的BLAST程序检索数据库，对VamF3H基因全长cDNA序列及其氨基酸序列进行比对分析；利用ProtParam在线软件（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）分析VamF3H基因编码蛋白质的理化性质；运用ProtScale在线软件（http：//ca.expasy.org/tools/protscale.html）、TMHMM在线软件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0）、SignalP在线软件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）对所编码蛋白质的亲水性、疏水性、跨膜结构域、信号肽进行分析；通过ExPASY中的HNN工具分析其蛋白质序列的二级结构；采用GeneDoc软件进行多序列比对，并采用MEGA 6.0软件构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 山葡萄VamF3H基因cDNA全长的克隆及序列分析

以山葡萄果皮总RNA反转录的cDNA为模板，用特异引物F1和F2扩增出1条324 bp的预期片段（图1-a）。经Blastn分析发现，该序列与其他物种F3H基因高度同源，与欧亚种葡萄（FQ389950）的同源性高达99%，初步确认其为山葡萄F3H基因的核心序列。根据所得中间段序列设计末端扩增的特异引物F3H-a和F3H-s，经RACE扩增、产物克隆、测序后，分别得到长度为965 bp的3′末端和647 bp的5′末端（图1-b）。将RT-PCR和RACE扩增片段进行序列拼接得到VamF3H基因cDNA全长序列，最终获得1条长为1 398 bp的cDNA全长序列，经Blastn比对发现，该cDNA序列与其他物种的F3H基因同源。

经DNAstar软件分析发现，该cDNA包含1个1 092 bp的完整开放阅读框、214 bp的3′-非翻译区、92 bp的5′-非翻译区，推测其编码363个氨基酸。GenBank登录号为KP966099，将其命名为VamF3H。

2.2 VamF3H基因编码蛋白质的理化性状

利用ProParam软件在线预测分析VamF3H基因编码蛋

白的理化性质，发现该蛋白由363个氨基酸组成，相对分子质量（MV）为40.81 ku，等电点值为5.37。组成VamF3H蛋白的20种氨基酸中亮氨酸（Leu）含量最高，达到9.9%；半胱氨酸（Cys）、色氨酸（Trp）含量最少，仅为1.4%。正电荷残基（Arg+Lys）数为45个，负电荷残基（Asp+Glu）数为55个，不稳定指数为44.25，脂肪指数为84.33，表明VamF3H基因蛋白属于不稳定蛋白质。

2.3 VamF3H蛋白保守区预测

利用NCBI的BlastP程序，在蛋白保守区数据库预测山葡萄VamF3H基因的蛋白保守区。结果表明，VamF3H具有2-酮戊二酸的双加氧酶（2-ODD）结构域、非血红素双加氧酶结构域。VamF3H具有特征性结构域FE2OG_OXY PS51471（图2），属于双加氧酶家族。

2.4 VamF3H蛋白的亲水性

利用ProtScale程序分析山葡萄VamF3H基因氨基酸序列的亲水性及疏水性（图3）。图中纵坐标为氨基酸标度值，横坐标为氨基酸序列位置。依据氨基酸分值越低亲水性越强、分值越高疏水性越强的规律，可明显看出疏水性最大值在第168位点，值为1.900；最小值在第145位点，值为-2.722。总平均亲水性指数为-0.444，整体表现为亲水性。

2.5 VamF3H蛋白的跨膜结构域

根据TMHMM、TMpred Server网站分析，超过500分才被认为显著。可见VamF3H蛋白无跨膜螺旋，故可推测VamF3H不含有跨膜结构域。

2.6 VamF3H蛋白的信号肽预测及二级结构

利用SignalP 4.1 Server软件对山葡萄VamF3H基因蛋白进行信号肽预测。结果表明，VamF3H基因编码的蛋白不具有信号肽。

利用HNN软件在线预测VamF3H基因的二级结构（图4）。该蛋白的二级结构由48.48%的无规卷曲（random coil）、32.78%的α-螺旋（alpha helix）、18.73%的β-折叠（extended strand）组成。

2.7 山葡萄VamF3H编码蛋白质的同源性及进化

登陆NCBI主页，利用BlastP在线软件将克隆得到的VamF3H基因编码氨基酸序列进行同源性搜索比较。结果表明，该基因与欧亚种葡萄（FQ389950）、圆叶葡萄（KF040970）、美洲种葡萄（JX087441）、桑树（KF438044）等的F3H类基因同源性较高，相似性分别为99%、99%、96%、81%。利用GeneDoc软件对包括VamF3H在内10个物种的F3H基因编码的氨基酸序列进行多重比对分析（图5），图中划线部分为保守结构域。

为进一步分析VamF3H与其他植物F3H之间的进化关系，在多重比对的基础上，利用Mega 6.0软件对该基因及其他植物F3H基因的氨基酸序列进行系统进化分析（图6）。结果表明，山葡萄VamF3H基因与欧亚种葡萄、圆叶葡萄、美国蔓藤的同源性最高，与梨、风毛菊等亲缘关系较远。

3 结论与讨论

本研究利用同源克隆和RACE技术相结合的方法，从山葡萄果皮中克隆获得F3H的同源基因VamF3H，并对其编码的蛋白质进行生物信息学分析。二级结构预测发现，该蛋白的二级结构以无规卷曲为主，其次为α-螺旋，再次为β-折叠，无其他二级结构元件，此预测结果与已报道的草莓、葡萄、海棠F3H蛋白的二级结构一致[17]。保守结构域分析表明，该基因编码的蛋白具有典型2-O-酮戊二酸和Fe2+-依赖的双加氧酶家族（2OG-FeⅡ_Oxy）的保守结构域，该结构域中含有与铁离子结合所需的组氨酸、天冬氨酸，以及与2-O-酮戊二酸结合所需的精氨酸、丝氨酸保守位点，这些都是植物双加氧酶超家族基因的典型特征。系统进化分析显示，VamF3H与同属的欧亚种葡萄F3H亲缘关系最近，而与蔷薇科的梨、菊科的风毛菊亲缘关系较远，可见VamF3H的进化具有明显的种属特性。

从以上核苷酸、氨基酸较高的相似系数可知，F3H基因在进化上较为保守，因为F3H仅以单拷贝形式存在于大多数物种中，提示F3H基因可能在花青素生成中具有重要地位。单拷贝基因比多拷贝基因更易于调控，且F3H基因在进化上保守性很高，少数几个碱基的突变就可能造成基因失活，从而阻碍花青素的生成。目前，关于控制花青素生成的研究主要集中于控制花青素生成的结构酶，并通过转入结构酶的基因以获得结构酶的过量表达，从而增加花青素的生成，而关于调控结构酶的基因或调控因子的研究尚未见报道；因此，研究花色素调控基因比单纯研究结构酶更具有意义。

通过获得的F3H基因cDNA全长序列，可在以下方面做进一步研究。验证F3H基因在山葡萄中是否为单拷贝存在。F3H基因在很多物种中均以单拷贝存在，而葡萄中的F3H则为2个拷贝[18-20]，因此推测VamF3H也同为2个拷贝。可使用Southem Blot技术验证F3H基因在山葡萄的果皮、果肉、根、茎、叶、种子等部位中是否为2个拷贝。将已有的F3H基因作为探针，与山葡萄基因组文库杂交，可获得F3H基因组DNA序列，以进行内含子组成、外显子组成、结构预测等分子生物学分析，为山葡萄花色素的研究提供分子生物学基础。

参考文献：

[1]张 龙，李卫华，姜淑梅，等. 花色素苷生物合成与分子调控研究进展[J]. 园艺学报，2008，35（6）：909-916.

[2]张学英，张上隆，骆 军，等. 果实花色素苷合成研究进展[J]. 果树学报，2004，21（5）：456-460.

[3]Holton T A，Cornish E C. Genetics and biochemistry of anthocyanin biosynthesis[J]. The Plant Cell，1995，7（7）：1071-1083.

[4]Zuker A，Tzfira T，Ben-Meir H，et al. Modification of flower color and fragrance by antisense suppression of the flavanone 3-hydroxylase gene[J]. Molecular Breeding，2002，9（1）：33-41.

[5]Lepiniec L，Debeaujon I，Routaboul J M，et al. Genetics and biochemistry of seed flavonoids[J]. Annual Review of Plant Biology，2006，57：405-430.

[6]Forkmann G，Heller W，Grisebach H. Anthocyanin biosynthesis in flowers of Matthiola incana、Favanone-3-hyroxylase and flavonoid-3′-hydroxylase[J]. Zeitschrift Fur Naturforschung C-A Journal of Biosciences，1980，35（9/10）：691-695.

[7]Martin C，Prescott A，Mackay S，et al. Control of anthocyanin biosynthesis in flowers of Antirrhinum majus[J]. Plant Journal，1991，1（1）：37-49.

[8]Britsch L，Ruhnau-Brich B，Forkmann G. Molecular cloning，sequence analysis，and in vitro expression of flavanone 3 beta-hydroxylase from Petunia hybrida[J]. The Journal of Biological Chemistry，1992，267（8）：5380-5387.

[9]Deboog B，Albertsen M C，Taylor L P. Flavanone3-β-hydroxylase transcripts and flavonol accumulation are temporally coordinate in Maize anthers[J]. Plant Journal，1995，7（5）：703-713.

[10]Charrier B，Coronado C，Kondorosi A，et al. Molecular characterization and expression of alfalfa（Medicago sativa L.）flavanone-3-hydroxylase and dihydroflavonol-4-reductase encoding genes[J]. Plant Molecular Biology，1995，29（4）：773-786.

[11]Pelletier M K，Shirley B W. Analysis of flavanone 3-hydroxylase in Arabidopsis seedlings. Coordinate regulation with chalcone synthase and chalcone isomerase[J]. Plant Physiology，1996，111（1）：339-345.

[12]葛玉香，沈育杰，李晓红，等. 山葡萄种质资源评价与利用研究现状[J]. 中外葡萄与葡萄酒，2000（4）：16-20.

[13]沈育杰，赵淑兰，杨义明，等. 我国山葡萄种质资源研究与利用现状[J]. 特产研究，2006，28（3）：53-57.

[14]王 军. 生物技术与葡萄遗传育种[J]. 中国农业科学，2009，42（8）：2862-2874.

[15]Jin Z P，Grotewold E，Qu W Q，et al. Cloning and characterization of a flavanone 3-hydroxylase gene from Saussurea medusa[J]. DNA Sequence，2005，16（2）：121-129.

[16]Daldoul S，Chenenanoui S，Mliki A，et al. Improvement of an RNA purification method for grapevine（Vitis vinifera L.）suitable for cDNA library construction[J]. Acta Physiologiae Plantarum，2009，31（4）：871-875.

[17]Shen H X，Zhang J，Yao Y C，et al. Isolation and expression of McF3H gene in the leaves of crabapple[J]. Acta Physiologiae Plantarum，2012，34（4）：1353-1361.

[18]Sparvoli F，Martin C，Scienza A，et al. Cloning and molecular analysis of structural genes involved in flavonoid and stilbene biosynthesis in grape（Vitis vinifera L.）[J]. Plant Molecular Biology，1994，24（5）：743-755.

[19]Jeong S T，Goto-Yamamoto N，Kobayashi S，et al. Effects of plant hormones and shading on the accumulation of anthocyanins and the expression of anthocyanin biosynthetic genes in grape berry skins[J]. Plant Science，2004，167（2）：247-252.

[20]Waters D L，Holton T A，Ablett E M，et al. cDNA microarray analysis of developing grape（Vitis vinifera cv. Shiraz）berry skin[J]. Functional & Integrative Genomics，2005，5（1）：40-58.邝良德，任永军，谢晓红，等. 家兔DGAT1基因的克隆及其组织表达谱分析[J]. 江苏农业科学，2015，43（10）：41-44.