siRNA沉默SIRT1基因对宫颈癌细胞HeLa增殖和凋亡的影响

吴 琦，于 红，张文卿

(青岛大学医学院医学微生物学教研室，山东 青岛 266071)

沉默信息调节因子2相关酶1(silent mating type information regulation 2 homolog 1，SIRT1)是依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)的去乙酰化酶类，SIRT1通过对多种组蛋白及非组蛋白底物的去乙酰化作用，调节基因转录表达和染色质重塑，进而参与代谢、细胞分化、衰老、凋亡及肿瘤发展等生理及病理生理过程［1］。研究表明SIRT1与肿瘤的发生发展及耐药密切相关，有望成为肿瘤表观遗传学治疗的良好靶标［2］。RNA 干扰(RNA interference，RNAi)是双链RNA介导的转录后基因沉默，导入细胞后双链RNA可特异性地识别并结合与其序列互补的核酸片段，进而降解内源性的mRNA，形成特定基因的表达沉默［3-4］。RNA干扰具有高特异性和高效性的特点，已成为研究基因功能、信号传导通路、肿瘤治疗的重要工具之一。本研究化学合成靶向 SIRT1的 siRNA(small interference RNA，siRNA)并转染宫颈癌细胞株 HeLa，观察 siRNA SIRT1对HeLa细胞增殖和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

人宫颈癌细胞株HeLa由本实验室保存。靶向SIRT1的siRNA(5'-ACUUUGCUGUAACCCUGUAdTdT-3')及无义序列siRNA委托Life technology公司合成;Lipofectamine RNAiMAX转染试剂购自Life technology公司。hGAPDH、SIRT1基因引物由Life technology公司合成。细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)购自武汉博士德生物工程有限公司;P53一抗、P21一抗、Survivin一抗为北京博奥森生物技术有限公司产品;β-actin一抗、辣根过氧化物酶标记的二抗为北京中杉生物技术有限公司产品;SIRT1一抗购自Abcam公司。HRP增强型化学发光底物SuperSignal West Pico购自Thermo Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 siRNA SIRT1转染条件的优化 分别用终浓度为15、30及45 nmol/L的siRNA SIRT1转染30% ～50%汇合的HeLa细胞，同时设阴性对照组(转染通用无义序列siRNA)及正常细胞对照组，于转染后72 h倒置相差显微镜下观察细胞形态，收集细胞，提取细胞总RNA进行RT-PCR检测。

1.2.2 RT-PCR检测SIRT1 mRNA 于转染后72 h收集各组细胞，Trizol法提取细胞总RNA，应用RT-PCR检测SIRT1 mRNA表达水平。SIRT1 PCR反应条件:预变性94℃、10 min，变性 94℃、1 min，退火47 ℃、1 min，延伸72 ℃、1 min，30 个循环后，延伸72℃、10 min。内参照hGAPDH PCR反应条件:预变性94℃、10 min，变性94℃、30 s，退火55 ℃、30 s，延伸72 ℃、1 min，30个循环后，延伸72℃、10 min。扩增产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳。凝胶成像系统对目的条带进行扫描，Image J软件进行灰度分析，计算SIRT1灰度值与hGAPDH灰度值之比，即SIRT1 mRNA的相对表达量。每组实验重复3次。SIRT1及hGAPDH引物序列见表1。

表1 PCR引物序列Table 1 Sequence of PCR primers

1.2.3 Western blot检测 SIRT1 及凋亡相关蛋白转染72 h后收集各组细胞并加入WIP组织细胞裂解液提取细胞蛋白，BCA法检测蛋白浓度，常规进行Western blot检测，一抗稀释比例为1∶(300～3000)，二抗稀释比例为1∶5000，化学发光法显色。Image J软件进行灰度分析，将目的基因与内参β-actin条带的灰度值比值作为目的基因的相对表达量。每组实验重复3次。

1.2.4 CCK-8法检测细胞增殖 HeLa细胞接种于96孔板，每孔3×103个细胞，倒置相差显微镜观察细胞至30% ～50%汇合，以终浓度30 nmol siRNA SIRT1转染HeLa细胞。转染后72 h，每孔加10 μL CCK-8溶液，继续孵育2 h，酶标仪测450 nm处吸光度值。细胞增殖抑制率(%)=(正常组A值－实验组A值)/正常组A值×100%。

1.2.5 Hoechst33258核染色 取 siRNA转染后72 h的HeLa细胞，常规进行Hoechst33258染色，荧光显微镜下观察细胞形态。

1.2.6 Annexin-Ⅴ检测细胞凋亡 收集转染后72 h各组细胞，调整细胞密度至(2～5)×105/mL，于Ep管中依次加入100 μL单细胞悬液及100 μL Guava Nexin Reagent(含有 Annexin V-PE和7-ADD的缓冲液)混匀避光，室温孵育20 min，流式细胞仪上样分析细胞凋亡率。

1.2.7 统计学分析 采用 SPSS 13.0统计软件进行统计学处理，实验数据以均数±标准差(¯χ±s)表示，采用单因素方差分析 RT-PCR、Western blot结果，以检验水准 α =0.05，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 siRNA SIRT1转染条件的优化

倒置相差显微镜观察结果显示，与正常HeLa细胞组比较，不同剂量 siRNA SIRT1(15、30、45 nmol/L)转染细胞72 h后，均可见大量脱落变圆的细胞。RT-PCR结果显示，与正常HeLa细胞组相比，各转染组细胞中SIRT1 mRNA的表达水平均明显下降，其中以30 nmol/L的siRNA作用最为明显，因此，后续实验选用30 nmol/L作为siRNA的转染浓度(图1)。

图1 不同剂量siRNA SIRT1对HeLa细胞SIRT1 mRNA的影响Fig.1 Effect of various concentration of siRNA on SIRT1 mRNA expression

2.2 RT-PCR检测结果

RT-PCR检测结果表明，与正常HeLa细胞组相比，siRNA SIRT1转染组细胞中SIRT1 mRNA水平明显下降，差异有显著性(图2，P ＜0.05)，而阴性siRNA转染组、转染试剂对照组细胞SIRT1 mRNA水平无显著性差异(P＞0.05)。

2.3 Western blot检测结果

Western blot检测结果表明，与正常组相比，siRNA SIRT1转染组细胞SIRT1、Survivin蛋白表达水平明显下调(P＜0.01)，P53、P21蛋白表达水平明显上调(P＜0.01);阴性 siRNA转染组SIRT1、P53、P21、Survivin 蛋白表达水平的变化无显著性(P＞0.05);转染试剂对照组SIRT1、P21蛋白表达水平的变化无显著性(P＞0.05)，但Survivin蛋白相对表达量降低(P＜0.05，图3)。

图2 RNA干扰对SIRT1 mRNA的表达影响Fig.2 Effect of RNA interference on the expression of SIRT1 mRNA

2.4 细胞增殖检测结果

CCK-8结果显示，siRNA SIRT1转染HeLa细胞72 h后，对HeLa细胞的增殖有明显的抑制作用，siRNA SIRT1转染组抑制率为39%，明显高于其他3组(图4)，表明siRNA SIRT1可抑制HeLa细胞增殖。

2.5 Hoechst33258 核染色

荧光显微镜下显示，正常对照组、阴性siRNA转染组及转染试剂对照组细胞的细胞核呈均匀淡蓝色，而siRNA SIRT1转染组细胞出现凋亡形态学改变，细胞核染色质高度浓缩，可观察到亮蓝色细胞核(图5)。

2.6 AnnexinⅤ-PE检测细胞凋亡

结果显示，正常组凋亡率为3%，阴性siRNA转染组凋亡率为3.9%，转染试剂对照组凋亡率为3.3%，siRNA SIRT1转染组凋亡率为15.9%。siRNA SIRT1转染组细胞凋亡率明显高于其他3组，表明siRNA SIRT1可诱导HeLa细胞凋亡(P＜0.05，图 6)。

图3 RNA干扰对SIRT1及凋亡相关蛋白表达的影响Fig.3 Effect of RNA interference on the expression of SIRT1 and apoptosis related protein

图4 RNA干扰对HeLa细胞增殖的影响Fig.4 Effect of RNA interference on HeLa cell proliferation

图5 HeLa细胞的Hoechst33258染色(200×)Fig.5 Hoechst33258 stain of HeLa cells(200 × )

图6 AnnexinⅤ-PE检测HeLa细胞凋亡Fig.6 AnnexinⅤ-PE analysis of apoptosis in HeLa cells

3 讨论

乙酰化/去乙酰化是一种重要的组蛋白修饰方式，由组蛋白乙酰化酶(histone acetylase，HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)催化完成［5］。SIRT1属于Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶家族成员，SIRT1不仅去乙酰化修饰多种组蛋白，还可以去乙酰化作用多种非组蛋白，包括转录因子P53，叉头蛋白盒转录因子 FOXO，核因子-κB(nuclear factor κB，NF-κB)等，进而影响与肿瘤细胞增殖及凋亡密切相关的多种蛋白活性［6］。研究表明SIRT1在肿瘤中呈异质性表达，随肿瘤类型的不同 SIRT1的表达水平不一致［6-7］，因此，将SIRT1归为癌基因还是抑癌基因仍存在争议。大多数文献报道SIRT1在贲门癌、急性髓性白血病、人前列腺癌、原发性结肠癌、乳腺癌等肿瘤组织中持续高表达，且具有钝化抑癌基因和DNA损伤修复蛋白的作用，被认为是肿瘤促进因子［1，6-7］。但也有研究报道在某些特定的情况下，SIRT1起到抑癌因子的作用，Firestein等研究证实，将SIRT1转入APCmin/+小鼠结肠癌中，SIRT1可抑制肿瘤的形成和生长［8］。进一步研究证明，SIRT1通过去乙酰化作用抑制癌基因β-catenin、NF-κB的转录和癌蛋白活性，从而起到肿瘤抑制因子的作用。

目前关于SIRT1与宫颈癌的相关性研究鲜见文献报道。有学者报道沉默宫颈癌细胞株SiHa中HPV E7蛋白，可下调SIRT1蛋白的表达;在原代人角质形成细胞中过表达HPV E7蛋白，可上调SIRT1蛋白及其磷酸化的表达，提示SIRT1可能参与了HPV致宫颈癌发生发展的过程［9］，但SIRT1在宫颈癌中的作用及详尽机制尚不清楚。

本实验参照文献［10］设计针对SIRT1基因的siRNA，转染HeLa细胞，结果表明siRNA SIRT1能明显下调SIRT1的表达，抑制HeLa细胞增殖并诱导细胞凋亡。在此基础上，本研究进一步检测了凋亡相关蛋白P53、P21及Survivin的表达，结果表明P53、P21表达上调，Survivin表达下调，提示siRNA SIRT1诱导的细胞凋亡与P53通路密切相关。P53为肿瘤抑制因子，在DNA损伤、紫外线、化学药物刺激、异常细胞生长时可在细胞核内聚集，通过调控P21、Bax、Survivin等下游蛋白的活性，抑制细胞分裂和促进细胞凋亡［11-12］。其中P21蛋白不仅能够与cyclin/cdk形成复合物使细胞周期停滞在G1期，而且还可以通过C端与增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)相互作用，阻断PCNA活化DNA聚合酶的活性从而抑制DNA的合成，使细胞周期停滞［13］;而Survivin为凋亡抑制蛋白家族成员，可直接或通过P21间接作用于Caspase和周期蛋白激酶，阻断凋亡信号转导通路，抑制各种刺激诱导的细胞凋亡过程，P53通过对Survivin启动子的调控，发挥其负向调节作用［14］。因此，推测沉默SIRT1基因诱导的HeLa细胞凋亡与P53、P21及Survivin通路关系密切，但是由于SIRT1作用底物较多，底物间相互作用机制复杂，siRNA SIRT1诱导的细胞凋亡的详尽机制尚有待进一步探索。

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