QuEChERS样品制备方法应用于LC/MS和LC/UV测定橙汁中多菌灵和其他康唑类杀菌剂

本文讨论了橙汁中康唑类杀菌剂（包括多菌灵）的样品制备策略。首先，使用QuEChERS方法的DisQuE产品进行样品制备，用以检测各种水果、蔬菜和果汁中的杀虫剂含量。结合QuEChERS方法，UPLC/MS/MS可以轻易检测出10μg/L（ppb）包括多菌灵在内的5种康唑类杀菌剂，且无需进行进一步的样品制备操作。QuEChERS提取液可以作为前体样品，然后进一步净化并使用液相色谱UV检测器分析其中ppb水平的多菌灵和其他康唑类杀菌剂目标分析物。利用Oasis MCX小柱进行固相萃取（SPE）可对待测物进行富集，并减少基质干扰。该方法通过使用配备UV检测的液相色谱可完成多菌灵样品在低ppb水平的准确定量。Oasis MCX净化操作虽然不是UPLC/MS/MS分析的必需步骤，却能够减少基质效应而得到更加洁净的提取物。因此，使用QuEChERS方法DisQuE产品制备的样品适用于UPLC/MS/MS直接分析，及经混合模式SPE富集和净化之后的HPLC/UV测定。

沃特世解决方案

Xevo？ TQ质谱；ACQUITY UPLC？ H-Class系统；ACQUITY UPLC BEH C18柱；XBridgeTM BEH C18XP色谱柱；DisQuETM试剂袋产品；Oasis？ MCX萃取柱；LCMS认证样品瓶。

实验

用作质谱分析的UPLC条件

系统：ACQUITY UPLC H-Class；

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18，2.1×100mm，1.7μm（部件编号：186002352）；

进样量：10μL；

温度：40℃；

流动相A：0.1%NH4OH水溶液；

流动相B：0.1%NH4OH甲醇溶液；

流速：0.40mL/min；

梯度：流动相B初值为10%，4分钟内线性梯度增至90%，保持5分钟，降回至10%B，持续5.1分钟。保持并再平衡7分钟。

用作XP色谱柱UV分析的HPLC条件

系统：ACQUITY UPLC H-Class；检测：PDA检测器；

色谱柱：X B r i d g e C1 8X P，4.6×100mm，2.5μm（部件编号：186006039）；

进样量：50μL；

温度：40℃；

流动相A：20mm磷酸钾水溶液（pH6.8）；

流动相B：乙腈；

流速：1.3mL/min；

梯度：25%B的初值保持3.4分钟，9.7分钟内线性梯度增至65%B，保持11.0分钟，然后线性梯度增加至95%，保持13.0分钟，之后降回至25%B，持续13.2分钟。保持并再平衡18.3分钟。

样品制备

使用QuEChERS方法进行初步提取：将15mL橙汁样品加到50mL的离心管内。加入15mL1%乙酸乙腈（ACN）溶液，振摇1分钟。加入为AOAC QuEChERS方法准备的DisQuE试剂（部件编号186006812），剧烈摇匀1分钟。然后在3000rpm下离心5分钟。对不使用固相萃取，直接进行UPLC/ MS/MS分析的样品，将0.5mL上清液加水稀释至1.0mL。

SPE净化：使用Oasis MCX小柱的固相萃取方法可对碱性化合物（例如康唑类杀菌剂）进行净化。准备进行LC/UV分析前（如果需要净化样品），从QuEChERS提取物中取2mL上清液，加入6mL0.01M HCl水溶液，然后混均。使用一根3cc Oasis MCX柱进行固相萃取净化操作。QuEChERS提取液以酸性水溶液稀释，从而提高混合模式SPE保留，同时水溶液稀释增加了反相保留。

质谱条件

质谱仪：Waters？ Xevo TQ。

结果与讨论

使用QuEChERS方法能够在UPLC/ MS/MS分析之前有效地萃取康唑类杀菌剂。其中的一种杀菌剂——多菌灵，未经注册却被确证出现在市售的橙汁样品中。本实验通过质谱分析实现了该化合物在1ppb的水平上的确证，同时LC/ UV检测限也达到了10ppb水平。研究结果显示，使用了QuEChERS样品制备方法的DisQuE产品，不仅能够对康唑类杀菌剂进行有效的UPLC/MS/MS分析，而且通过适当的净化操作步骤，还能使用LC/UV检测出较低ppb水平的杀菌剂。

以上测定结果也验证了一个重要的结论：对于大部分基质中存在的多种杀菌剂及相关化合物，QuEChERS方法是一种非常有效的样品制备技术。随后的样品净化程度完全取决于分析人员的需求、检测方法的灵敏度和特异性。分析过程表明，虽然SPE净化步骤只是推荐性而非高效率的UPLC/MS/MS分析所必需的过程，但是另一方面，要实现低ppb水平的多菌灵LC/UV测定，则必须进行包括随后Oasis MCX的固相萃取过程。

不使用SPE净化的UPLC/MS/MS分析

通过对每种杀菌剂的10ppb加标（多菌灵为1ppb）橙汁样品的UPLC/MS/MS重现图谱的分析，使用外标计算方法得到的五点基质匹配曲线（未示出）中，所有康唑类杀菌剂的相关系数（r2）都大于0.995。根据橙汁基质中制备的3份平行样品得到的结果测定康唑杀菌剂的回收率，其范围为92%～110%且相对标准偏差（%）小于7%。回收率实验的具体操作方法：分别在QuEChERS萃取之前和萃取后的果汁样品中进行杀菌剂加标，并将两者所得的MRM峰面积进行对比。基质效应（抑制比%）由QuEChERS萃取后的杀菌剂加标上清液的MRM峰面积与用50∶50乙腈/水制备的等量杀菌剂标准品峰面积进行对比得出。

使用SPE净化的LC/UV分析

使用SPE净化的LC/UV回收率与100ppb水平加标样品的UPLC/MS/MS分析结果相似。图1是使用XP色谱柱的LC/UV方法测定抑霉唑、腈苯唑和苯醚甲环唑所得的色谱图。多菌灵和噻菌灵在可见的280nm至300nm处缺少有效发色团；然而在220nm处却能达到很高的灵敏度，这在很大程度上是因为使用了紫外可穿透的流动相（磷酸钾）。

已测样品的分析

图2是对已测橙汁样品分析得到的LC/UV色谱图。可看出使用Oasis MCX小柱可获得高水平样品净化效果。上方为未使用SPE净化的色谱图，下方为使用Oasis MCX净化后的色谱图。图3是同时使用QuEChERS方法和Oasis MCX小柱净化后得到的色谱图，以及对相同的样品只使用QuEChERS方法而未使用Oasis MCX小柱净化的UPLC/MS/MS图谱。结果吻合度良好，LC/UV检测到11ppb的多菌灵，UPLC/MS/MS检测到13ppb的多菌灵。在受检的橙汁样品中未鉴别出其他杀菌剂。图4是已测样品的UV图谱与ppb标准品得到的参比图谱的对比，证实了橙汁样品中残留物的存在。

结论

DisQuE试剂袋（QuEChERS）能够有效地从橙汁中萃取康唑类杀菌剂；该方法可提供高通量和低检测限的分析，分析过程快速、简单、稳定、安全；QuEChERS提取液可直接用于UPLC/MS/ MS分析，而不用进一步净化；简洁的Oasis MCX固相萃取流程为低ppb检测限的多菌灵UV检测提供了有效的样品净化和富集方法；Oasis MCX固相萃取净化能够增强UPLC/MS/MS的分析性能，即使这一步骤并非必需过程；经固相萃取净化后的橙汁样品中的多菌灵，其LC/UV与UPLC/MS/MS分析结果达到一致。endprint