富勒烯单大环多胺衍生物对辐射引起小鼠急性肝损伤的保护作用研究

陈琪萍 何佳恒 王关全 罗顺忠 马宗平 刘国平

（中国工程物理研究院核物理与化学研究所 绵阳 621900）

核能与核技术的发展使得放射性物质被广泛用于各行各业，与此同时，发生核辐射事故的几率也逐渐增大。急性放射损伤多在放射医学防护实践中，对体内受照者的医学处理措施有两类：一是应用相应的药物，以减少放射性核素在进入部位的吸收或加速体内沉积核素的排出；二是用局部清洗、灌洗或手术的方法，除去沉积于某部位的核素。但核辐射事故一旦发生，其实际情况往往涉及的地域大、人员多、伤情复杂，后者不能满足实际要求。因此，防治防护的根本措施主要是通过减少吸收和加速放射性核素在体内的排除，即寻找合适的核素阻吸剂或促排剂。研究表明富勒烯具有优良的自由基清除功能，如果将富勒烯与具有核素促排功效的基团联结，可望获得性能更优的放射性重核素促排化合物，在实现促排的同时兼清除体内产生的自由基，即实现促排和抗自由基作用的双重功能[1−3]。基于此，我们将富勒烯作为特殊基团引入到具有强螯合功能的大环多胺化合物中，希望在提高作为促排剂的大环多胺化合物的促排性能同时对受损伤肌体进行一定程度的修复。在前期研究中发现富勒烯大环多胺衍生物对铀有一定的促排作用[4]，本研究将衍生物通过尾静脉注射的方式注入受照动物体内，考察衍生物对射线致损伤的修复效果。

由于水的含量约占生物体的80%，辐射使水分子电离成H+和OH−自由基，当环境物理因素或外源性化学物质直接或间接诱导产生的自由基得不到及时清除，或自由基的产生和清除失去平衡时，常会造成自由基对机体的损伤。线粒体是对损伤极为敏感的细胞器，不仅参与细胞的能量代谢，也是自由基产生的主要场所，线粒体受到自由基攻击后其形态、结构和功能均可能发生病理改变。生物体在遭受损伤时，往往发生脂质过氧化作用，过氧化作用的产物比较复杂，其产物之一的丙二醛(Malondialdehyde, MDA)可以抑制蛋白质的合成，研究中常以MDA含量来反映脂质过氧化的水平和对细胞膜的伤害程度，因而寻找有效的抗自由基的保护剂，对于防治放射损伤具有重要意义。

国内外学者对富勒烯的制备、纯化、结构测定、理化性质等方面都进行了大量的研究工作[5−8]，在清除自由基方面亦有报道[4,9]，但对氧自由基损伤的直接保护作用未见报道，我们采用小鼠肝线粒体自由基损伤模型研究富勒烯衍生物的细胞保护作用，可以为研究射线照射早期机体功能损害的临床防治提供新的实验依据。

1 设备与材料

Beckman J2-21M 冷冻离心机，贝克曼仪器公司；RS2000 X射线生物辐照系统，剂量率1.7cGy·s−1；Flash varioskan 酶标仪，美国 Thermo公司；SN3400N扫描电子显微镜，日立公司。

昆明种小白鼠，18−20 g，8周龄，第三军医大学实验动物中心提供。

富勒烯单大环多胺衍生物(CA)(2.75 mg·mL−1)本实验室制备，纯度≥95%；MDA试剂盒，南京建成生物技术公司；Folin-酚蛋白定量试剂盒，北京鼎国生物技术有限责任公司；线粒体分离液：0.25mol·L−1蔗糖-1 mmol·L−1二乙基三胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)混合溶液（42.7875g蔗糖，0.3722g Na2EDTA，溶于500 mL水，调pH=7.6）。

2 实验方法

2.1 富勒烯单大环多胺衍生物的合成及表征

CA结构式见图1。

图1 CA的结构Fig.1 Structure of CA.

合成路线及表征参考文献[4]。

经1H NMR和13C NMR检测CA的纯度≥95%。

2.2 分组与辐照

实验组分为正常对照组、辐射损伤组和促排剂保护组，促排挤保护组又分为事前保护组和事后干预组，每组五只小鼠，除正常对照组外，每组分别接受12 Gy、20 Gy、40 Gy和80 Gy的X射线辐照。另外取小鼠五只，提取线粒体后将所得的线粒体合并作为离体鼠肝线粒体，分为正常对照组、辐射损伤组、事前保护组和事后干预组，除正常对照组外，每组分别接受20 Gy和40 Gy的X射线辐照。

2.3 小鼠肝线粒体的提取

解剖小鼠，取出肝脏，尽量剔去筋膜，用预冷的磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffered solution, PBS)缓冲溶液(pH=7.4)洗去血液，吸干血水；用小剪刀于冰浴的小烧杯中将肝剪成小块，用分离液将剪好的组织块转移到预冷的玻璃匀浆器中，上下均匀匀浆；匀浆液1 000 r·min−14 ºC 离心10 min；取上清液，12 000 r·min−14 ºC 离心10 min；弃上清液，加约5 mL分离液用光滑玻璃棒轻轻悬浮起上层沉淀，吸取移至离心管内，加入分离液12000r·min−14 ºC 离心10min，重复两次，黄褐色沉淀物即为鼠肝线粒体。线粒体蛋白含量用 Folin-酚蛋白定量试剂盒(Lowry法)测定，并测定线粒体肿胀度和线粒体 MDA含量[10]。

2.4 线粒体蛋白含量测定

线粒体蛋白含量测定采用市售的 Folin-酚试剂盒。其测试原理是：在酸性条件下，考马斯亮兰G-250染料与蛋白质疏水区结合，颜色由棕色变为蓝色，该蓝色化合物颜色的深浅与蛋白质浓度的高低成正比关系。将稀释的标准牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum, BSA)与检测试剂混合，测量在650 nm处的吸收值，在建立由一系列稀释的BSA建立的标准曲线的情况下，蛋白质的浓度可以根据标准曲线而确定。

2.5 线粒体MDA含量测定

取肝线粒体匀浆20 μL，按照MDA测定试剂盒说明书的步骤加样，漩涡混合器混匀，95 ºC水浴40 min，流水冷却，532 nm测吸光度，蒸馏水调零，测各样品吸光度值。

式中，CMDA为待测样品MDA含量；Ad为测定管吸光度值；Ac为对照管吸光度值；As为标准管吸光度值；Ab为空白管吸光度值；Cs为标准品浓度；Cp为待测样品蛋白浓度。

2.6 线粒体肿胀度测定

线粒体肿胀程度与线粒体的生理和病理性反应有关，过度的肿胀则是线粒体结构损伤的表现。本实验将活体小鼠分为事前保护组和事后干预组，事前保护组小鼠在预先注入一定剂量的CA后1 h接受80 Gy的X射线辐照，24 h后提取肝线粒体；事后干预组小鼠预先接受80 Gy的X射线辐照，照后立即注入一定剂量的CA，24 h后提取肝线粒体。新鲜的线粒体经辐照后，若发生线粒体肿胀，将表现为悬液混浊度下降，在520 nm处的光密度降低。线粒体按 500 μg·mL−1线粒体蛋白的量重悬于测定液中，37 ºC恒温水浴振荡60 min，分别于0 min、15 min、30 min、60 min取线粒体悬液用酶标仪测定520 nm处的吸光度，吸光度的变化直接反映线粒体损伤程度。

用于测定线粒体肿胀度的线粒体蛋白置于冰浴，放置加测定的时间不超过48 h，以保持线粒体膜的完整性。

3 结果与讨论

3.1 MDA含量

鼠肝线粒体在辐照作用下，脂质过氧化物水平增加。本实验观察促排药物CA对鼠肝线粒体脂质过氧化物生成的作用。结果表明，线粒体经X射线辐照损伤后，其MDA含量显著增加。表1为活体小鼠事前保护组和事后干预组的MDA测量结果，从表1看出，小鼠不管是在预先注射CA或是照射后注射CA的情况下都能明显抑制线粒体MDA生成，事前保护组的平均抑制率为46%，事后干预组平均抑制率为60%，与照射组比较有统计学显著性意义，但尚不能降低至正常对照组水平。表2为小鼠离体线粒体事前保护组和事后干预组的MDA测量结果，从表2可以看出，鼠肝线粒体在X射线辐照作用下，脂质过氧化物水平增加，而促排剂 CA有较强的抑制线粒体脂质过氧化物生成的能力。

表1 CA对活体鼠肝线粒体脂质过氧化物的影响( ±s, n=5) ±sTable 1 Effect of CA on the lipid peroxidation products of rat liver mitochondria in vivo (, n=5).

表1 CA对活体鼠肝线粒体脂质过氧化物的影响( ±s, n=5) ±sTable 1 Effect of CA on the lipid peroxidation products of rat liver mitochondria in vivo (, n=5).

组别Group蛋白含量Protein content / μg·mL−1 MDA含量MDA content / μmol·g−1平均抑制率Inhibit rate / %事前保护组Protect beforehand CA-12 Gy 960.50±56.52 15.96±0.94 28.59 CA-20 Gy 800.50±89.36 17.49±1.95 45.05 CA-40 Gy 920.50±34.08 15.21±0.56 56.60 CA-80 Gy 888.80±80.49 18.75±1.70 53.50事后干预组Treatment afterward CA-12 Gy 883.83±47.01 10.56±0.56 52.75 CA-20 Gy 830.50±49.52 8.03±0.47 74.77 CA-40 Gy 820.50±70.40 13.00±1.12 63.39 CA-80 Gy 815.50±65.84 20.44±1.65 49.31正常组 Normal group 812.17±108.21 7.39±0.98 ―对照组Contrast group 12 Gy 1 073.83±84.79 22.35±1.76 ―20 Gy 1 047.17±136.88 31.83±4.16 ―40 Gy 938.83±77.18 35.51±2.92 ―80 Gy 1 190.50±148.58 40.32±5.03 ―

表2 CA对离体鼠肝线粒体脂质过氧化物的影响(± s, n=5)Table 2 Effect of CA on the lipid peroxidation products of rat liver mitochondria in vitro (± s, n=5).

表2 CA对离体鼠肝线粒体脂质过氧化物的影响(± s, n=5)Table 2 Effect of CA on the lipid peroxidation products of rat liver mitochondria in vitro (± s, n=5).

组别Group蛋白含量Protein content / μg·mL−1 MDA含量MDA content / μmol·g−1平均抑制率Inhibit rate / %事前保护组Protect beforehand CA-20 Gy 728.83±56.08 19.21±1.48 39.65 CA-40 Gy 813.83±128.08 18.84±2.97 46.94事后干预组Treatment afterward CA-20 Gy 1 010.50±136.63 17.81±2.41 44.05 CA-40 Gy 1 003.83±125.04 15.94±1.99 55.11对照组Contrast group 20 Gy 1 047.17±92.10 31.83±2.80 ―40 Gy 938.83±70.83 35.51±2.68 ―正常组Normal group 812.17±30.05 7.39±0.27 ―

3.2 促排药物对鼠肝线粒体肿胀度的影响

线粒体辐射损伤后可出现肿胀，表现为线粒体悬液在 520 nm处的吸光度降低，实验结果见图2和表3（每组五只小鼠）。经X射线照射的小鼠肝线粒体在60 min时吸光度降低值明显减少，提示线粒体已经处于肿胀状态。小鼠静脉注射CA后，肝线粒体受X射线诱发产生肿胀的程度明显低于辐射损伤组肝脏线粒体，不管是事前保护组还是事后干预组均对小鼠肝细胞线粒体肿胀度有明显抑制作用，数据见表3。对照组线粒体肿胀程度明显增加，事前保护组小鼠对线粒体肿胀的平均抑制率为35.4%，事后干预组小鼠对线粒体肿胀的平均抑制率为61.4%，可见线粒体肿胀均受抑制。

图2 CA对活体小鼠肝线粒体肿胀度的影响Fig.2 Effects of CA on rat liver mitochondria swelling.

表3 CA对线粒体肿胀度的影响(±s, n=5)Table 3 Effects of CA on mitochondria swelling (±s, n=5).

表3 CA对线粒体肿胀度的影响(±s, n=5)Table 3 Effects of CA on mitochondria swelling (±s, n=5).

组别Group线粒体肿胀度Mitochondria swelling平均抑制率Inhibit rate正常组Normal group 0.075±0.009 ―损伤对照组Contrast group 0.497±0.023 ―事前保护组Protect beforehand 0.321±0.015 35.4%事后干预组Treatment afterward 0.192±0.011 61.4%

3.3 促排药物对X射线诱导的小鼠急性肝损伤组织结构的影响

肝切片采用电镜观察，2.5%戊二醛固定，环氧树脂包埋，常规电镜切片，观察线粒体形貌。辐照前线粒体大部分细胞核形态结构正常，染色质分布正常，核膜清晰，核周隙无扩张，细胞质丰富；内质网、线粒体结构正常；线粒体嵴较清晰，内质网未见水肿，见图3(a)。辐射损伤组小鼠经40 Gy辐照后24 h取肝组织样本电镜观察：细胞局部可见明显水肿，红细胞进入窦周隙，汇管区静脉及肝内血窦轻度扩张，肝细胞水肿坏死较明显；48 h后可见细胞间隙明显增宽，线粒体变大变圆，部分转化为小空泡状结构，线粒体呈现水肿状态；第4天个别细胞可见明显破损，内质网水肿，囊腔扩张，肝血窦及窦周隙破损，淤血明显，见图3(b)−(d)。图3(e)−(h)分别为提前注射和照后注射CA后的小鼠肝细胞切片，电镜可见：细胞核形态结构正常，染色质分布正常，核膜清晰，核周隙无扩张，细胞质丰富，细胞器结构正常，线粒体嵴清晰，内质网未见水肿，细胞间隙结构清晰，胆小管清晰无扩张、微绒毛清晰。与急性辐射损伤组相比具有明显的细胞修复效果。

4 结语

实验对富勒烯单大环多胺衍生物保护下的小鼠肝线粒体MDA含量、线粒体肿胀度及其形貌进行了测定和观察，结果表明，X射线辐照可诱发小鼠机体线粒体受到损伤，从线粒体肿胀度测定和肝组织学切片均显示线粒体发生水肿。MDA含量测定显示射线照射后的细胞生成脂质过氧化物——丙二醛等物质含量升高，小鼠在体和离体肝损伤实验结果表明CA能有效抑制射线引起的MDA升高，与照射组比较有统计学显著性意义，事前或事后注射CA对MDA的生成的抑制率均可达到50%以上，但尚不能降低至正常对照组水平，提示可能对线粒体膜有保护作用；线粒体肿胀度测定结果显示事前保护组小鼠对线粒体肿胀的平均抑制率为 35.4%，事后干预组小鼠对线粒体肿胀的平均抑制率为61.4%，可见线粒体肿胀均受到抑制；肝脏组织学切片电镜照片可见，X射线照射引起的肝组织急性辐射损伤随时间的延长，坏死程度加重，而注射CA对肝细胞具有一定的保护和修复作用，与辐射损伤对照组相比，较好地维护了线粒体结构的完整性，其机制可能与富勒烯基类促排剂具有清除过量自由基、维持体内抗氧化系统的平衡有关。

图3 小鼠肝脏组织学切片Fig.3 Histological slice of rat liver.

1 Henge-Napoli M H, Stradling G N, Taylor D M, eds.Decorporation of radionuclides from the human body[M].UK, Ashford: Nuclear Technology Publishing, 2000

2 Gama S, Gil M, Gano L,et al. Combined chelation of bi-functional bis-hydroxypiridinone and mono-hydroxypiridinone: synthesis, solution andin vivoevaluation[J].Journal of Inorganic Biochemistry, 2009, 103: 288−298

3 Manna D, Ghanty T K. Enhancement in the stability of 36-atom fullerene through encapsulation of a uranium atom[J]. Journal of Physical Chemistry, 2013, 117:17859−17869

4 何佳恒, 刘国平, 张华明, 等. 富勒烯大环多胺衍生物的合成及对铀的促排[J]. 核技术, 2013, 36(12): 120301 HE Jiaheng, LIU Guoping, ZHANG Huaming,et al.Synthesis of a fullerene macrocyclic derivative and its effect on excretion promotion of uranium[J]. Nuclear Techniques, 2013, 36(12): 120301

5 Antoine L, Delphine L, Stephane P R. Sequestering agent for uranyl chelation: a new family of CAMS ligands[J].Tetrahedron, 2008, 64: 6662−6669

6 Ansoborlo E, Amekraz B, Moulin C,et al. Review of actinide decorporation with chelating agents[J]. Comptes Rendus Chimie, 2007, 10: 1010−1019

7 Evelyne M G, Cyrille M, Ramon B,et al. Design and synthesis of new polyphosphorylated upper-rim modified calix[4] arenes as potential and selective chelating agents of uranyl ion[J]. Tetrahedron, 2008, 65: 1516−1523

8 Marcin S, Delphine L, Gerard G,et al. Bisphosphonate sequestering agents synthesis and preliminary evaluation forin vitroandin vivouranium(VI) chelation[J].European Journal of Medicinal Chemistry, 2008, 43:2768−2777

9 李蓉, 任泂, 冷言冰. 对急性贫铀中毒的促排措施研究[J]. 第三军医大学学报, 2009, 6: 461−464 LI Rong, REN Jiong, LENG Yanbing. Comparing the efficacy of several substances for decoporating depleted uranium[J]. Acta Academiae Medicnae Militaris Tertiae,2009, 6: 461−464

10 徐莉, 曹颖, 张敏. 线粒体酶活性及线粒体肿胀与不同运动强度的关系[J]. 中国组织工程研究, 2012, 16:7893−7896 XU Li, CAO Ying, ZHANG Min. Effects of different exercise intensities on the activity of mitochondrial enzymes and mitochondrial swelling[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2012, 16: 7893−7896