响应面分析法优化壳聚糖复合海绵的制备工艺

刘传荣，陈思浩，郑玉林，陈玉双，杨秋杰，周超，朱同贺，楼建中

（1上海工程技术大学化学化工学院，上海 201620；2上海新亚药业有限公司技术中心，上海 201203；3北卡罗兰纳农工州立大学化工与机械工程学院，NC 27411，USA）

在科学实验的条件优化中，线性回归分析可以利用实验数据得出因素与指标（即响应值）之间的回归方程，但要求数据量较大，耗时耗资，且只讨论一种因素的影响，无法考虑几种因素的综合作用；正交试验设计可同时考虑几种因素，并寻找最佳因素水平组合，但它不能在给出的整个区域上找到因素和响应值之间的一个明确的函数表达式即回归方程，从而无法找到整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值。因此，一种试验次数少、周期短、求得的回归方程精度高、能充分反映多种因素间交互作用的多元优化方法——响应面分析法[1-2]成为本文采用的方法。响应面分析法在多个科学领域多有使用，能够通过回归方程的分析来寻求最优工艺参数，同时还可以直观地表达出各因素间的交叉作用。

近年来，海绵在药学和医学领域受到了广泛的关注，主要研究方向是作为伤口敷料[3]、组织工程支架材料等。海绵医用敷料[4-8]是医用敷料的一种，是一类弹性、多孔的固体材料。它不仅具有传统医用敷料[9]保护伤口的作用，还具有各种不同的物理、化学性能以及良好的生物性能。例如海绵医用敷料具有较好的吸水性、保湿性、耐酸耐碱性、灭菌性和生物相容性等特性，可以减少感染和促进伤口愈合，且能较好地吸收渗出液和药液，不会造成二次伤害，可减轻患者疼痛。

海绵剂系由亲水性胶体溶液经发泡、固化、冻干、灭菌而制成的一种海绵状固体制剂，常用作创面或外科手术辅助止血剂[10-12]。海绵的制备方法及研究进展在文献资料中已有大量报道，本研究将响应面分析[13-14]法首次应用于复合海绵材料的制备工艺中，以期对复合海绵的开发利用提供理论指导。本实验选择壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸钠3种辅料制备海绵多孔材料，可同时利用三者的优点，避免三者在敷料方面使用的不足，既可保证壳聚糖的可降解性、灭菌性和较好的机械强度，又可以利用海藻酸钠较好的吸水性和透明质酸钠的生物相容性。壳聚糖分子链上具有伯氨基，海藻酸钠和透明质酸钠的分子链上都具有羧基，壳聚糖是通过静电作用与海藻酸钠和透明质酸钠结合形成的聚电解质复合物[15]。壳聚糖加入透明质酸钠材料内，既可避免由透明质酸钠的溶解性较好，导致的存留时间短，也可以使壳聚糖显示出更强的抗水解作用[16]。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

壳聚糖（CS，脱乙酰度 80.0～95.0）、海藻酸钠（SA，化学纯）、乙酸（冰乙酸），国药集团化学试剂有限公司；透明质酸钠（SH），阿拉丁试剂（上海）有限公司。

真空冷冻干燥箱，德国 CHRiST；电子剥离试验机（BLD-200N）、傅里叶转变红外分光光度计（Nicolet AVATAR 370型），美国Thermo Fisher公司；扫描电子显微镜（JSM-5600LV），日本 JEOL公司；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9123A），上海精宏实验设备有限公司；电动搅拌机（RW20 DS25），德国 IKA公司。

1.2 方法

1.2.1 壳聚糖复合海绵制备工艺流程

工艺流程见图1。

图1 壳聚糖复合海绵制备工艺流程

1.2.2 海绵复合材料的拉伸强度测试

根据GB/T2792—1998所述，根据试验要求，用相应宽度的取样刀制取试样，选择试验所需的试验速度150 mm/min使用BLD-200N电子剥离试验机进行拉伸强度测试。

2 结果与讨论

2.1 复合海绵材料制备过程中的单因素影响

在进行响应面分析之前，应先通过单因素实验来选择实验因素与水平[17-18]。在本实验中影响海绵拉伸强度的因素很多，如壳聚糖[19]与海藻酸钠[20]的配比、透明质酸钠[21]的浓度、电机搅拌速度、冷冻干燥的时间等。本实验采用冷冻干燥法，将海绵材料冷冻干燥至恒重，避免了由于含水量不同对拉伸强度的影响。

2.1.1 壳聚糖与海藻酸钠的配料比

本实验中控制透明质酸钠的浓度和电机搅拌速度不变，测定不同壳聚糖与海藻酸钠的物料配比条件下制得的海绵样品的拉伸强度，结果如图2所示。

由图2所示，在透明质酸钠浓度与电机搅拌速度一定的情况下，壳聚糖与海藻酸钠的配比为4∶1时，复合海绵材料的拉伸强度最大，因此可将壳聚糖与海藻酸钠的配比范围从4∶1左右延伸，即可确定此因素的“水平”。如表1，该因素的三水平取值为 3∶1、4∶1、5∶1。

图2 壳聚糖与海藻酸钠的配料比对拉伸强度的影响

2.1.2 透明质酸钠的质量分数

本实验中控制壳聚糖与海藻酸钠的物料配比为4∶1和电机搅拌速度不变，测定不同透明质酸钠质量分数的条件下制得的海绵样品的拉伸强度，结果如图3所示。

如图3所示，透明质酸钠的质量分数在15%时拉伸强度最大，因此可将透明质酸钠的质量分数从15%向左右延伸，即可确定此因素的“水平”。如表1，该因素的三水平取值为10%、15%、20%。

2.1.3 电机搅拌速度对拉伸强度的影响

本实验中控制壳聚糖与海藻酸钠的物料配比为4∶1和透明质酸钠的质量分数为15%不变，测定不同电机搅拌速度条件下制得的海绵样品的拉伸强度，结果如图4所示。

如图4所示，电机搅拌速度为500 r/min时，海绵材料的拉伸强度最大，此后在700～900 r/min过程中拉伸强度有增大趋势，这是由于随着电机搅拌速度增加剪切力增大海绵的结构更加密集。但是与此同时海绵孔结构孔径更加小，不利于后续应用，故此时500 r/min为最佳搅拌速度。因此可将搅拌速度 500 r/min向左右延伸，即可确定此因素的“水平”。如表1，该因素的三水平取值为400 r/min、500 r/min、600 r/min。

图3 透明质酸钠的含量对拉伸强度的影响

图4 电机搅拌速度对拉伸强度的影响

2.2 采用响应面分析法优化海绵制备工艺

2.2.1 响应面分析因素水平的选取

根据Box-Benhnken的中心组合实验设计原理，综合2.1节中单因素实验结果，选取壳聚糖与海藻酸钠配比、透明质酸钠含量、电机搅拌速度对作为复合海绵材料的拉伸强度的影响显著的3个因素，在单因素实验的基础上采用三因素三水平的响应面分析方法[22-23]，试验因素与水平设计见表1。

2.2.2 响应面分析方案及结果

以壳聚糖与海藻酸钠的物料比A、透明质酸钠浓度B、转速C为自变量，以符合海绵材料的拉伸强度为响应值（Y），进行响应面分析试验。试验方案及结果见表2。

2.2.3 多元二次响应面回归模型的建立与分析

对表2试验结果通过Design-Expert软件程序进行二次回归响应面分析，建立多元二次响应面模型：

各因素的方差分析见表3。

模型的F值145.55意味着回归模型显著（P＜0.05）。失拟值0.0620表明失拟项（Lack of Fit）不显著，模型的拟合性较好。从表 3中可以看出，A（电机搅拌速度）、B（透明质酸钠的含量）、C（壳聚糖与海藻酸钠的配比）、AB、AC、A2、B2、C2是显著的模型项（P＜0.05）；而BC的Prob＞F值大于0.1000，表明模型项不显著（BC）。

表1 响应面分析因素及水平

表2 响应面分析方案及实验结果

表3 二次响应面回归模型方差分析

电机搅拌速度和透明质酸钠含量的影响较大，壳聚糖与海藻酸钠的配比影响较小，其中电机搅拌速度和透明质酸钠含量已达到极著显著水平。

由以上分析得出，本试验中AB的交互作用和AC的交互作用影响显著，试验结果见图5、图6，BC的交互作用见图7。

由图5可以看出，当透明质酸钠含量处在某一固定水平时，转速对制剂拉伸强度的影响均出现了由低到高再由高到低的趋势，即在试验范围内，转速对拉伸强度的影响出现了最优点。同样，当转速一定时，透明质酸钠的含量对拉伸强度的影响也出现了最优点。两者对转速的影响都比较明显，由此可以看出，在转速及透明质酸钠含量的交互作用中，两个因素对拉伸强度的影响都很大。

由图6可以看出，当m(CS)/m(SA)比处在某一固定水平时，转速对制剂拉伸强度的影响出现了最高点，是一个由低到高再由高到低的过程，即在试验范围内，转速对拉伸强度的影响出现了最优点。但在转速一定时，m(CS)/m(SA)配比对拉伸强度的影响相比之下并不明显。综合来看，在转速及m(CS)/m(SA)配比的交互作用中，转速对拉伸强度的影响大于 m(CS)/m(SA)配比的影响，是主效应因子。

由图7可以看出，当CS/SA配比处在某一固定水平时，透明质酸钠含量对制剂拉伸强度的影响比较明显，均有最高点的出现。而在透明质酸钠含量一定时，CS/SA配比对拉伸强度的影响并不明显，近似成一条直线。综合来看，在透明质酸钠含量及CS/SA配比的交互作用中，透明质酸钠对拉伸强度的影响大于CS/SA配比的影响，是主效应因子。

2.2.4 最优方案及其表征

由 Expert-Design软件得到的最佳选择和通过实验的比较结果如表4。

（1）红外光谱分析（FTIR） Nicolet AVATAR 370型 FTIR红外分光光度计分别对 CS、SH、SA及壳聚糖复合海绵进行官能团测试，扫描次数为32次，分辨率为2 cm−1。如图8所示。

从图8和表5可以看出，在3250～3600 cm−1处为—OH键吸收峰，在2800～3000 cm−1处为 CH3和CH2的C—H伸缩振动峰，在1500～1700 cm−1处为 C=O 伸缩振动峰，在 1400 cm−1处左右为C—H 的弯曲振动峰；在1150 cm−1处左右为C—N伸缩振动峰；在1000～1100 cm−1处为C—O伸缩振动峰。此外，海藻酸钠 在1607 cm−1处的C=O伸缩振动峰吸收峰在壳聚糖复合海绵中向低频位移到1550 cm−1，向低波数方向偏移了57 cm−1，说明发生了静电作用形成了复合物。透明质酸钠在 1630 cm−1处的C=O伸缩振动峰吸收峰在壳聚糖复合海绵中向低频位移到1550 cm−1，向低波数方向偏移了80 cm−1，说明发生了静电作用形成了复合物。

图5 搅拌速度A与透明质酸钠含量B的交叉影响的响应面及等高线图

图6 搅拌速度A和壳聚糖与海藻酸钠的物料比C的交叉影响的响应面及等高线图

图7 透明质酸钠含量B及壳聚糖与海藻酸钠物料比C的交叉影响的响应面及等高线图

图8 红外吸收光谱图

表4 最佳方案表

（2）扫描电镜分析（SEM） 将制备好的壳聚糖复合海绵进行喷金处理，在扫描电镜下进行观察记录。

图9 SEM电镜扫描图

表5 吸收峰及其范围

通过电镜放大分析后，可以看到壳聚糖-海藻酸钠-透明质酸钠海绵表面拥有致密层，且具备均匀的多孔与多层次的结构，孔径适中，是结构良好的海绵状材料，并且照片中有明显的交联现象。

（3）吸水性能测试 对采用最优方案制备的海绵进行吸水性能测试，海绵自重m1为0.0938 g，海绵充分吸收水后的质量m2为5.6592 g，由此，吸水率Q=( m2− m1)/m1×100%为 5933.3%。

（4）保水性能测试 对采用最优方案制备的海绵进行吸水性能测试，海绵自重m1为0.1058 g，海绵充分吸收水后又经充分离心后的质量 m2'为2.6726 g，由此，保水率 Q'=( m2'− m1)/m1为 2426.1%。

3 结 论

（1）本实验应用响应面设计法直观分析了电机搅拌速度、透明质酸钠含量及壳聚糖海藻酸钠配比几个因素对复合海绵状拉伸强度的影响及各因素的交互影响。

（2）响应面分析表明电机搅拌速度和透明质酸钠含量对复合海绵状的拉伸强度影响较大，已达到极著显著水平。壳聚糖与海藻酸钠的配比相比之下影响较小。

（3）优化出的最佳工艺条件：电机搅拌速度为541 r/min，透明质酸钠质量分数为14%，壳聚糖与海藻酸钠的配比为 3.71∶1，得到理论拉伸强度为0.1652 MPa，实际拉伸强度为0.1709 MPa。

（4）实验结果显示，该海绵材料具有均匀的多孔与多层次的结构，吸水、保水性能均良好。

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