LC-MS在中药指纹图谱研究中的应用

朱振兴，杨瑞芳

(1.郑州市中医院，郑州 450052;2.河南中医学院第二附属医院，郑州 450000）

高效液相-质谱联用技术(high performance liquid chromatogrphy-mass spectrometry，LC-MS）将二者的优势进行了结合，即高效液相进行分离，质谱进行检测，即使复杂的混合物也能被HPLC分离，而质谱则能提供高灵敏度的检测，从而获得化合物的结构信息。二者的联用能够发挥各自的最大优势和避免彼此的短处，从而获得两种仪器单独使用时所不具备的功能［1］。中药材指纹图谱系指中药材经处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药材特性的共有峰的图谱［2］。指纹图谱和中医的思维方式相似即一种整体性和模糊性的思维方式，和传统的中药质量控制模式比较其更有优势，既强调不同种中药的差异性又突出同种中药的相似性。中药指纹图谱可以整体的、宏观的和可以量化的信息［3］，中药指纹图谱的建立可以采用多种分析方法，而现代分析方法的发展刚好满足了这一要求［4］。该文就LC-MS在中药指纹图谱研究的应用做一综述。

1 LC-MS发展概况

LC-MS联用技术在20世纪70年代开始研制，至今已有40多年的发展史，已经发展为一种成熟、常规的分离分析方法，在医药、生物、化工、农业、环境各个领域得到广泛应用［1］。

LC-MS仪的分类:根据质谱(mass spectrometry，MS）离子源(接口）和质量分析器的不同可以将LCMS仪分为不同的类型。按离子源分类:热喷雾离子源、大气压化学电离源、电喷雾离子源等。按质量分析器分类:液相色谱-四极杆质谱仪，液相色谱-离子阱质谱仪，液相色谱-飞行时间质谱仪，以及液相色谱-质谱-质谱联用仪，如三重四级杆质谱仪，四级杆飞行时间质谱仪等。

1.2 LC-MS联用仪的组成 LC-MS联用仪主要由高效液相色谱，接口装置(同时也是电离源），质谱仪和数据处理系统组成。高效液相部分与一般的液相色谱相同。

LC-MS联用的关键是二者之间的接口装置，由于LC和MS工作状态的差异较大，二者的匹配较气相色谱-质谱联用仪(gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）难度更大。接口装置的主要作用是去除溶剂并使样品离子化。LC-MS自从研制以来出现过多种接口装置如传送带接口、热喷雾接口、粒子束接口、快原子轰击接口等［1］。20世纪80年代，大气压电离源用作LC-MS联用仪的接口装置和电离装置后，使LC-MS联用技术提高了一大步。目前，几乎所有的LC-MS联用仪都使用大气压电离源作为接口装置和离子源。大气压电离源(atmospheric pressure ionization，API）包括电喷雾离子源(electrospray ior source，ESI）和大气压化学离子源(atmospheric pressure chemicl ionization，APCI）两种，二者之中电喷雾源应用最广。

1.3 常用离子源(接口）简介 LC-MS联用出现的各种接口装置中以ESI应用最为广泛，其工作原理(见图1）为:溶剂由液相泵输送到金属毛细管喷嘴，毛细管加有2～4 kv的高压，由于高压和雾化气的作用，流动相从毛细管顶端流出时，会形成扇状喷雾。电喷雾离子化可分为3个过程:①形成带电小液滴:由于毛细管被加高压，发生氧化还原反应，形成带电液滴。②溶剂蒸发和小液滴碎裂:溶剂蒸发，离子向液滴表面移动，液滴表面的离子密度越来越大，当达到Rayleigh(瑞利）极限时，即液滴表面电荷产生的库仑排斥力于液滴表面的张力大致相等时，液滴会非均匀破裂，分裂成更小的液滴，在质量和电荷重新分配后，更小的液滴进入稳定态，然后再重复蒸发、电荷过剩和液滴分裂这一系列过程。③形成气相离子:对于半径＜10 nm的液滴，液滴表面形成的电场足够强，电荷的排斥作用最终导致部分离子从液滴表面蒸发出来，而不是液滴的分裂，最终样品以单电荷或多电荷离子的形式从溶液中转移至气相，形成了气相离子。在大气压条件下形成的离子在强电位差的驱动下，经取样孔进入质谱真空区。

图1 ESI电离源工作原理示意图

离子源(liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometev，LC-ESI-MS）谱图主要给出准分子离子的相关信息以及大量的多电荷离子，而较少出现碎片离子。LC-ESI-MS常用于强极性、热不稳定化合物及高分子化合物的检测。但ESI源对流量有一定的限制，即流量不能太大［1］。

APCI电离是在大气压条件下利用尖端高压(电晕）放电促使溶剂和其他反应物电离、碰撞，及电荷转移等方式，形成一个反应气等离子区，样品分子通过等离子区时，发生质子转移，形成了(M+H）+或(M-H）-离子或加和离子。一般ESI源加一个电晕放电针即APCI源。

APCI也是一种软电离技术，与ESI相比适于极性较小的化合物。

2 LC-MS在中药指纹图谱研究的应用

中药的现代研究虽然取得了很大的进展，但大多数中药的有效成分依然没有探明，作用机制更无从谈起，显然现行的靠单一指标评价中药的质量是片面的［5］。而高效液相色谱-二极管阵列检测器-质谱-质谱联用方式(HPLC-DAD-MS-MS）可以得到多维多息指纹图谱。所谓多维，即采用多种分析仪器联用模式。所谓多息，即特征谱应努力做到包括化学和药效两方面的信息。HPLC-DAD-MS-MS可以满足这方面的需求，液质联用指纹图谱可以提供中药药效和质量关系的信息，且较其他的分析手段更加系统全面［4］。

王源园等［6］采用HPLC-UV-MS法对牛膝药材的指纹图谱进行研究，得到分离度、重现性均较好的牛膝药材HPLC-UV指纹图谱，并借助HPLC-MS技术对其主要色谱峰进行了初步归属，从而为牛膝的质量控制提供了依据。张尊建等［7］采用HPLC-UVMS法对忍冬和山银花药材进行指纹图谱研究得到分离度和重复性均较好的忍冬和山银花药材HPLC-UV及HPLC-MS指纹图谱，分别对忍冬指纹图谱中8个色谱峰和山银花图谱中5个色谱峰进行了初步定性，并比较两种药材指纹图谱的差异。余静等［8］采用 HPLC-UV-MS法分别对刺五加药材水溶性和脂溶性成分进行指纹图谱研究，得到分离度和重现性均较好的刺五加药材HPLC-UV及HPLCMS指纹图谱，并分别对水溶性成分指纹图谱中5个色谱峰和脂溶性成分指纹图谱中8个色谱峰进行了初步定性，从而为刺五加药材及其制剂的鉴别提供更加全面、可靠的依据。韩凤梅等［9］采用高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱 (HPLC-ESI-MS）研究山麦冬甲醇提取物的指纹图谱，其中山麦冬甲醇提取物色谱图中有17个共有峰的重现性与精密度的RSD＜5%，HPLC-ESI-MS技术建立的山麦冬指纹图谱特征性强、重现性较好，可用于山麦冬的品质评价与品种鉴别。张尊建等［10］采用HPLC-UVMS对脉络宁注射液(石斛、牛膝、玄参和金银花）的指纹图谱进行研究，以绿原酸为参照峰，标示出脉络宁注射液10个共有峰，说明了其药材归属，并采用HPLC-MS对主要色谱峰进行了初步定性，该方法准确、重现性好，为脉络宁注射液的指纹图谱质量控制提供了依据。赵新峰等［11］建立了LC-ESI-MS定性分析六味地黄丸的方法，通过2级质谱识别了其中的9种化学成分，结果表明，六味地黄丸的总离子流色谱图比紫外色谱图具有更强的特征性，以质谱作为检测器是一种很好的研究中药指纹图谱的方法。刘思明等［12］采用高效液相电喷雾离子阱质谱对岩黄连注射液的指纹图谱进行研究，对其中的11种主要成分进行了指认，LC-UV对其中的2种成分进行了定量评价，所建指纹图谱能体现岩黄连注射液的特点，相似度评价和方法学考察结果良好，可用于岩黄连的质量控制及定量测定。戴德舜等［13］采用HPLC-MS的方法对桂枝汤A部分的双向调节样品与单向升温样品进行了指纹图谱研究，通过锁定色谱峰中主要分子量的方法对照了桂枝汤A部分两份不同药效样品，通过指纹图谱与MS离子流图相结合的方式分析了产生双向调节作用的物质基础，确认了样品中所含物质成分在量上的差异。晏媛等［14］采用液相色谱质谱联用技术对蒲公英灌肠液色谱图谱进行研究，通过质谱的质荷比M/Z及色谱保留时间的相互比较确定了咖啡酸、阿魏酸和原儿茶醛3种活性成分。王颖等［15］采用LC-MS技术测定了中药三七(包括药材、中间体及针剂成品）的指纹图谱。对中间体和成品则直接进样分析，并比较了三者的相关性。

综上所述，LC-MS主要用于中药的质量控制和物质基础研究，无论在药材还是制剂研究都得到了较广的应用。它弥补了传统方法定性鉴别、确定结构能力有限的缺点，解决了传统液相检测器灵敏度和选择性不够的缺点，可以提供可靠、精确的相对分子质量及结构信息，必将成为研究中药复杂物质体系的有力手段。

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