贝伐珠单抗引起肝癌细胞HepG2的血管内皮生长因子受体2上调表达

刘洪金，赵忠鹏，付 艳，杨鹏辉，段跃强，门 丽，赵 晖，杜 楠，王希良解放军总医院第一附属医院 肿瘤二科，北京 00048；军事医学科学院 微生物流行病研究所，北京0007

贝伐珠单抗引起肝癌细胞HepG2的血管内皮生长因子受体2上调表达

刘洪金1，赵忠鹏2，付 艳1，杨鹏辉2，段跃强2，门 丽2，赵 晖1，杜 楠1，王希良21解放军总医院第一附属医院 肿瘤二科，北京 100048；2军事医学科学院 微生物流行病研究所，北京100071

目的探讨贝伐珠单抗对肝癌细胞HepG2血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)相关受体的影响。方法 通过不同浓度的贝伐珠单抗降低培养液中VEGF来模拟低浓度VEGF的肿瘤微环境，RT-PCR、ELISA、Western blotting检测肿瘤细胞VEGF相关受体表达水平的变化。结果细胞培养液的VEGF浓度大幅度下降(P＜0.05)；可溶性VEGFR2的浓度出现了上升(P＜0.05)；HepG2细胞VEGF和VEGFR1表达水平无明显变化(P＞0.05)；VEGFR2表达水平出现了明显的上调(P＜0.05)。结论贝伐珠单抗导致了肝癌细胞HepG2大幅度上调了VEGFR2的表达。

贝伐珠单抗；肝癌细胞HepG2；血管内皮生长因子；血管内皮生长因子受体2

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)调控着血管内皮细胞的生长和代谢，在机体正常血管发育、血管相关病变和肿瘤血管侵袭方面起重要作用[1-3]。与血管关系密切的VEGF受体有两种，即VEGFR1和VEGFR2，与VEGF一起调控各种血管相关的病变或疾病发生[3-5]。贝伐珠单抗是VEGF的人源单克隆抗体，可有效地降低晚期肿瘤患者体内VEGF水平，很大程度上抑制了肿瘤血管生成，从而抑制肿瘤血管侵袭，为提高治疗效果及改善患者的生活质量提供了帮助[6-7]。以贝伐珠单抗和5-FU为基础的联合治疗已成为晚期侵袭性结肠癌治疗的经典方案[8]。但临床肿瘤治疗中贝伐珠单抗存在部分患者耐药及治疗后病情加重现象，这降低了贝伐珠单抗肿瘤治疗的效果[2,9]。本实验采用贝伐珠单抗降低肿瘤细胞培养微环境中的VEGF，模拟贝伐珠单抗治疗后患者体内低浓度VEGF环境，检测肝癌细胞系HepG2的VEGF受体变化，探究临床肿瘤治疗中贝伐珠单抗耐药的机制，为临床肿瘤药物治疗及多靶点药物治疗提供一些参考[10]。

材料和方法

1 材料 HepG2肝癌细胞株购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶均购于Hyclone。人源VEGF、VEGFR1、VEGFR2的ELISA试剂盒均购买于英骏公司(Invitrogen)。抗人VEGFR2抗体，抗人β-actin抗体，羊抗兔抗体(二抗)购自Cell signaling technology公司。

2 细胞培养 HepG2肝癌细胞株培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基。放置于37℃、5% CO2培养箱中，1 ～ 2 d换液1次，待贴壁细胞长满至80% ～ 90%时传代。当细胞达到对数生长期时开始试验。

3 样品处理 先将对数生长期的HepG2细胞铺于24孔培养板上，24 h后待细胞完全贴壁后更换为新鲜血清培养基，同时加入不同浓度的贝伐珠单抗药物。37℃温箱孵育48 h后，收集培养上清液，然后用冷PBS冲洗孔板2次，用ELISA细胞裂解液冰上裂解细胞30 min，4℃12 000 r/min离心5 min，收集上清，BCA法测量每孔细胞总蛋白，进行总蛋白定量。

4 ELISA实验 制备样品，依次把样品、标准品等体积加入相应的酶连条孔，按照产品说明书，依次加入相应的试剂，37℃温箱孵育，PBST进行孔板洗涤，最后加入反应终止液，OD490上机读取数值，绘制标准曲线，测出样品的含量。

5 RT-PCR检测mRNA表达 引物序列如下：VEGFA：forward primer TGAGATCGAGTACATCTTC AAGCC，reverse primer CACATTTGTTGTGCTGTAGG AAGC；VEGFR1：TGAGAAAGAATTTGATACGCAC C，CGCTGTCCATCTGCTCCTG；VEGFR2：forward primer CGGCAAATGTGTCAGCTTTG，reverse primer CACGTGGAAGGAGATCACCC。β-actin：forward primer GGACCTGACTGACTACCTCATGAAGAT；reverse primer TCGTAGCTCTTCTCCAGGGAGGAGCT。引物合成于生工生物工程(上海)有限，制备样品，Triozl法提取总RNA，AMV法逆转录cDNA，进行PCR和凝胶电泳，分析目的条带。

6 Western blot法测定VEGFR2的表达 制备样品，BCA法总蛋白定量，煮样，采用8%梯度聚丙烯酰胺凝胶，上样，电泳，采用PVDF膜转膜，封闭慢摇床，浸入稀释的一抗中(1∶500)，于摇床上4℃杂交过夜，TBST洗膜3遍。取出PVDF膜，洗膜后孵育二抗(1∶5 000)，摇床上杂交1 h。取出PVDF膜，TBST洗膜3遍。将ECL试剂盒内的两种试剂等体积混合后滴在PVDF 膜上，反应1 ～ 2 min，然后在暗屋中压X线片45 min后曝光，分析结果。7 统计学处理 采用SPSS15.0软件进行数据统计分析，数据用表示，采用单因素t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 VEGFA、VEGFR1和 VEGFR2的 mRNA水 平变化 加入终浓度400 ng/ml贝伐珠单抗，48 h后RT-PCR法检测细胞的mRNA水平。和对照组相比，药物组细胞内VEGFA表达水平无明显变化；VEGFR1和VEGFR2表达水平出现了上调。见图1。2 细胞和培养液上清的VEGFA蛋白水平 加入不同浓度贝伐珠单抗48 h后，ELISA法检测细胞和培养液上清VEGFA。和对照组相比，加入梯度浓度的贝伐珠单抗组肿瘤细胞VEGFA蛋白水平未发生明显变化；细胞培养液上清的VEGFA水平出现了明显降低，其降低幅度大致和贝伐珠单抗浓度呈相关关系。见图2。

图 1 RT-PCR法检测HepG2细胞mRNA表达水平Fig. 1 RT-PCR showing expression of VEGFR mRNA in HepG2 cells

图 2 ELSIA法检测HepG2细胞和培养液上清VEGFA蛋白含量A： HepG2细胞； B： 培养液上清Fig. 2 ELISA showing expression of VEGFA in HepG2 cells (A) and cultured supernatant (B)(aP＜0.05, bP＜0.01, vs 0 ng/ml)

3 HepG2细胞VEGFR1受体表达水平 加入不同浓度贝伐珠单抗48 h后，ELISA法检测细胞VEGFR1受体表达水平。和对照组相比，贝伐珠单抗组VEGFR1受体蛋白水平出现了少许上调，但差异无统计学意义。见图3。

4 HepG2细胞和培养液上清VEGFR2蛋白表达水平 加入不同浓度贝伐珠单抗48 h后，ELISA法检测细胞和培养液上清VEGFR2表达水平。和对照组相比，药物组细胞VEGFR2受体蛋白水平出现了明显上升趋势，其中200 ng/ml浓度组上升幅度最大；药物组培养液的可溶性VEGFR2也出现了上升趋势。见图4。

5 Western blot检测细胞内VEGFR2水平的变化趋势 和对照组相比，药物组细胞VEGFR2水平出现了上升趋势，其中200 ng/ml和400 ng/ml浓度组细胞VEGFR2上升幅度最大。见图5。

图 3 ELISA法检测HepG2细胞VEGFR1受体表达水平Fig. 3 ELISA showing expression of VEGFR1 in HepG2 cells

图 4 ELSIA法检测HepG2细胞内和培养液上清VEGFR2蛋白含量 A： HepG2细胞； B： 培养液上清Fig. 4 ELISA showing expression of VEGFR2 in HepG2 cells (A)and cultured supernatant (B)(aP＜0.05, bP＜0.01, vs 0 ng/ml)

图 5 Western blotting检测HepG2细胞的VEGFR2蛋白表达Fig. 5 Western blotting showing expression of VEGFR2 in HepG2 cells

讨 论

在临床肿瘤治疗中，贝伐珠单抗可抑制肿瘤血管转移，改善晚期肿瘤患者治疗效果。但贝伐珠单抗也存在治疗缺点，比如部分患者治疗效果不好或者耐药；治疗效果一过性及极少数患者治疗后病情加重[11]。因此，探究贝伐珠单抗治疗后肿瘤细胞相关代谢变化尤为必要[12-13]。

本实验采用贝伐珠单抗药物作用于肝癌细胞系HepG2，48 h后检测发现细胞内VEGF含量并未发生变化；而培养液上清VEGF含量发生了大幅度下降，贝伐珠单抗有效降低了细胞培养液上清的VEGF含量。实验结果发现，贝伐珠单抗导致了VEGFR2的大幅度上调；另一个受体VEGFR1无明显上调趋势，贝伐珠单抗还导致了培养液上清可溶性VEGFR2的上调。这表明贝伐珠单抗导致了低浓度VEGF培养环境，使肿瘤细胞的相关受体发生变化。文献表明VEGF与其相关受体可能参与肿瘤细胞的信号传递，比如VEGF与VEGFR2[14]。VEGFR2的上调加剧了肿瘤血管新生，而VEGFR2拮抗剂导致了肿瘤细胞增殖受到抑制[12-14]。这些表明了VEGF与VEGFR2的功能不仅限于血管内皮细胞，还很有可能参与肿瘤细胞增殖及侵袭。本实验表明，贝伐珠单抗引起了肿瘤细胞的VEGFR2大幅度上调；VEGFR2与肿瘤细胞增殖及侵袭关系密切，这表明贝伐珠单抗的耐药现象很可能是由于VEGFR2的上调表达导致的，这或许为探究贝伐珠单抗耐药及多靶点药物联合应用提供一些帮助[10,15]。

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2 Saharinen P， Eklund L， Pulkki K， et al. VEGF and angiopoietin signaling in tumor angiogenesis and metastasis［J］. Trends Mol Med， 2011， 17（7）： 347-362.

3 Yamazaki Y， Nakano Y， Imamura T， et al. Augmentation of vascular permeability of VEGF is enhanced by KDR-binding proteins［J］.Biochem Biophys Res Commun， 2007， 355（3）： 693-699.

4 Maes C， Stockmans I， Moermans K， et al. Soluble VEGF isoforms are essential for establishing epiphyseal vascularization and regulating chondrocyte development and survival［J］. J Clin Invest， 2004，113（2）： 188-199.

5 Des Guetz G， Uzzan B， et al. Microvessel density and VEGF expression are prognostic factors in colorectal cancer. Meta-analysis of the literature［J］. Br J Cancer， 2006， 94（12）：1823-1832.

6 Yang JC， Haworth L， Sherry RM， et al. A randomized trial of bevacizumab， an anti-vascular endothelial growth factor antibody， for metastatic renal Cancer［J］. N Engl J Med， 2003， 349（5）： 427-434.

7 Ducreux M， Adenis A， Pignon JP， et al. Efficacy and safety of bevacizumab-based combination regimens in patients with previously untreated metastatic colorectal Cancer： final results from a randomised phase II study of bevacizumab plus 5-fluorouracil，leucovorin plus irinotecan versus bevacizumab plus capecitabine plus irinotecan （FNCLCC ACCORD 13/0503 study）［J］. Eur J Cancer，2013， 49（6）： 1236-1245.

8 Hurwitz H， Fehrenbacher L， Novotny W， et al. Bevacizumab plus irinotecan， fluorouracil， and leucovorin for metastatic colorectal cancer［J］. N Engl J Med， 2004， 350（23）：2335-2342.

9 Tejpar S， Prenen H， Mazzone M. Overcoming resistance to antiangiogenic therapies［J］. Oncologist， 2012， 17（8）：1039-1050.

10 Shin SJ， Hwang JW， Ahn JB， et al. Circulating vascular endothelial growth factor receptor 2/pAkt-positive cells as a functional pharmacodynamic marker in metastatic colorectal cancers treated with antiangiogenic agent［J］. Invest New Drugs， 2013， 31（1）： 1-13.

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12 Fernando NT， Koch M， Rothrock C， et al. Tumor escape from endogenous， extracellular matrix-associated angiogenesis inhibitors by up-regulation of multiple proangiogenic factors［J］. Clin Cancer Res， 2008， 14（5）： 1529-1539.

13 Pohl A， El-Khoueiry A， Yang D， et al. Pharmacogenetic profiling of CD133 is associated with response rate （RR） and progressionfree survival （PFS） in patients with metastatic colorectal Cancer（mCRC）， treated with bevacizumab-based chemotherapy［J］.Pharmacogenomics J， 2013， 13（2）： 173-180.

14 Chatterjee S， Heukamp LC， Siobal M， et al. Tumor VEGF ：VEGFR2 autocrine feed-forward loop triggers angiogenesis in lung Cancer［J］. J Clin Invest， 2013， 123（4）： 1732-1740.

15 Michael M， Zalcberg J， Gibbs P， et al. A phase I trial of imatinib in combination with mFOLFOX6-bevacizumab in patients with advanced colorectal Cancer［J］. Cancer Chemother Pharmacol， 2013， 71（2）：321-330.

Bevacizumab up-regulates expression of VEGFR2 in HepG2 cells

LIU Hong-jin1, ZHAO Zhong-peng2, FU Yan1, YANG Peng-hui2, DUAN Yue-qiang2, MEN Li2, ZHAO Hui1, DU Nan1, WANG Xi-liang21No.2 Department of Oncology, First Affiliated Hospital of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100048, China;2Institute of Microbiology and Epidemiology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China
Corresponding author: DU Nan. Email: dunan05@aliyun.com; WANG Xi-liang. Email: xiliangw@126.com

ObjectiveTo study the role of bevacizumab in up-regulation of VEGFR2 expression in HepG2 cells.MethodsTumor microenvironment was simulated by decreasing the VEGF concentration with bevacizumab monoantibody. Expression of VEGF2 in HepG2 cells was detected by RT-PCR, ELISA and Western blot, respectively. Results The VEGF concentration was signi fi cantly decreased (P＜0.05) and the soluble VEGFR2 concentration was signi fi cantly increased in medium (P＜0.05). No signi fi cant change occurred in the VEGF and VEGFR1 expression level (P＞0.05) whereas the expression of VEGFR2 was signi fi cantly upregulated in HepG2 cells (P＜0.05).ConclusionBevacizumab up-regulates the expression of VEGF2 in HepG2 cells.

bevacizumab; HepG2 cell; vascular endothelial growth factor; vascular endothelial growth factor receptor 2

R 342

A

2095-5227(2014)05-0474-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.05.021

时间：2014-04-01 17:50

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140401.1750.008.html

2013-11-04

北京科委首都医疗特色项目(2131107002213040)

Supported by Beijing Municipal Commission of Science and Technology(2131107002213040)

刘洪金，男，在读硕士。研究方向：肿瘤分子靶向治疗。Email: liuhongjin1225@163.com。

杜楠，男，主任医师，硕士生导师。Email: dunan05@aliyun.com；王希良，男，研究员，硕士生导师。Email: xiliangw@126.com