高效液相色谱法同时测定膀胱镜胶中利多卡因与羟苯乙酯的含量*

王华栋，于 斐，刘向辉，汤晓阳，吴拥军#

1)河南省医疗器械检验所 郑州 450003 2)郑州大学公共卫生学院卫生化学教研室 郑州 450001

膀胱镜胶主要用于配套膀胱镜临床诊断。在实施膀胱镜检查前，将膀胱镜胶涂抹在膀胱镜前端起润滑导入作用。膀胱镜胶中常含有二甲基硅油、利多卡因、羟苯乙酯等成分。利多卡因起局部麻醉作用，例如无痛人工流产中的宫腔表面麻醉[1]，可降低患者黏膜敏感度、减轻疼痛。利多卡因在剂量较大时可能会引起眩晕、惊厥、呼吸抑制等神经系统反应[2]，也可能对心血管系统产生伤害，甚至引起过敏性休克导致死亡[3]。羟苯乙酯属于羟苯烷基酯类防腐剂，具有抑菌力强、毒性低和无刺激性的特点。羟苯乙酯用量不足时，达不到有效抑菌浓度;用量过大，又易引起不良反应。因此有必要对膀胱镜胶中利多卡因和羟苯乙酯的含量进行测定以控制产品质量。目前报道的利多卡因的分析方法有分光光度法[4]、液相色谱法[5]、化学发光法[6]等，羟苯乙酯的测定方法有分光光度法[7]、液相色谱法[8]等，但尚无同时测定膀胱镜胶中利多卡因和羟苯乙酯的报道。该研究采用高效液相色谱法同时测定了膀胱镜胶中利多卡因和羟苯乙酯的含量，报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 热电U3000液相色谱仪(配紫外检测器和自动进样器)，赛多利斯BP211电子天平，PE Lambda 35紫外可见分光光度计。利多卡因对照品(100342-201003)与羟苯乙酯对照品(100847-201102)均购自中国食品药品检定研究院;甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯;膀胱镜胶样品由江西某厂提供。

1.2 溶液制备

1.2.1 对照品储备溶液的制备 精密称取利多卡因对照品50 mg，置10 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为利多卡因对照品储备溶液。精密称取羟苯乙酯对照品50 mg，置50 mL量瓶中，同上处理制备羟苯乙酯对照品储备溶液。用前稀释至所需浓度。

1.2.2 供试品溶液和空白溶液的制备 精密称取膀胱镜胶2.5 g，置50 mL容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜滤过，作为供试品溶液。取按照产品配方配制的不含利多卡因和羟苯乙酯的空白样品，同法制备空白溶液。

1.2.3 磷酸盐缓冲液的制备 取0.1 mol/L磷酸二氢钠溶液28 mL、0.1 mol/L磷酸氢二钠溶液72 mL，加超纯水稀释至1 L，用磷酸调节pH至7.2备用。

1.3 色谱条件 色谱柱:DIONEX Acclaim PA2色谱柱(250.0 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:磷酸盐缓冲液(10 mmol/L，pH 7.2)-甲醇，体积比 350∶650;流速:1 mL/min;柱温:25℃;检测波长:256 nm(羟苯乙酯)和220 nm(利多卡因);进样体积:10 μL。

1.4 线性关系考察 取1.2.1项下2对照品储备溶液，用流动相逐级稀释为5个浓度梯度的混合对照品溶液，其中分别含利多卡因100.8～1008.0 mg/L和羟苯乙酯20.0～200.6 mg/L。按上述色谱条件分别进样10 μL，记录2成分峰面积，以浓度为横坐标，以相应成分的峰面积为纵坐标进行线性回归。

1.5 系统适用性及专属性考察 取1.2.1项下2对照品储备溶液各1 mL，用流动相稀释至50 mL作为系统适用性溶液。按1.3色谱条件进样10 μL，分别计算利多卡因和羟苯乙酯的理论塔板数、2峰分离度和不对称度。

分别取系统适用性溶液、供试品溶液和空白溶液，按1.3色谱条件进样10 μL，记录色谱图。观察配方中其他成分在利多卡因和羟苯乙酯峰位置有无吸收，确定该方法的专属性。

1.6 回收率实验 取供试品按照低、中、高3个浓度添加对照品溶液，稀释至线性范围内。按1.3色谱条件进样10 μL，记录色谱图。平行测定3次，按外标法以峰面积作为供试品溶液和3个浓度梯度加标溶液中利多卡因和羟苯乙酯的含量，计算回收率。

1.7 进样重复性与方法精密度实验

1.7.1 进样重复性 取膀胱镜胶1支，按1.2.2方法制备供试品溶液，按1.3色谱条件进样10 μL，记录色谱图。平行测定6次，计算2成分含量的RSD。

1.7.2 方法精密度 取同批号膀胱镜胶6支，按1.2.2方法平行制备6份供试品溶液，按1.3色谱条件进样10 μL，记录色谱图，分别测定。计算2成分含量的RSD。

1.8 灵敏度实验 按1.2.1方法制备对照品溶液，逐级稀释，按1.3色谱条件进样10 μL，记录色谱图。将相应峰高为仪器噪音3倍峰高作为检出限(S/N≥3)。

按1.2.1方法制备对照品溶液，逐级稀释，按1.3色谱条件进样10 μL，记录色谱图。将相应峰高为仪器噪音10倍峰高作为定量限(S/N≥10)。

1.9 稳定性实验 按1.2方法配制对照品溶液和供试品溶液，按1.3色谱条件，精密量取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，每隔2 h进样1次，共进样6次，分别根据峰面积计算出浓度，由浓度求出RSD。

1.10 样品测定 取3批膀胱镜胶，按1.2.2方法配制样品溶液，在1.3色谱条件下分别进样10 μL，平行测定3次，先计算出样品中2成分实际含量，然后计算实际含量占标示量的百分比。

2 结果

2.1 系统适用性及专属性 理论塔板数按利多卡因峰计算为13526，按羟苯乙酯峰计算为11000。2峰分离度大于10.0;不对称度 1.12 ～1.20。

配方中其他成分在利多卡因和羟苯乙酯峰位置均无吸收，表明该方法专属性良好(图1A、B)。

图1 膀胱镜胶中利多卡因和羟苯乙酯测定色谱图

2.2 线性关系结果 回归方程:Y=0.3321X+1.8462，r=0.9997(利多卡因);Y=0.7714X+0.1020，r=0.9995(羟苯乙酯)。

2.3 回收率实验结果 见表1。

2.4 进样重复性与方法精密度实验结果

2.4.1 重复性 利多卡因和羟苯乙酯含量的RSD分别为0.58%和0.31%。

2.4.2 精密度 利多卡因和羟苯乙酯含量的RSD分别为0.73%和0.30%。

2.5 灵敏度实验结果 以仪器噪音3倍峰高作为检出限，测得利多卡因的最小检出限为0.4 mg/L，羟苯乙酯的最小检出限为0.03 mg/L。以仪器噪音10倍峰高作为定量限，测得利多卡因的定量限为0.8 mg/L，羟苯乙酯的定量限为 0.16 mg/L。

表1 回收率实验结果

2.6 稳定性实验结果 12 h内，对照品溶液RSD为0.55%(利多卡因)、0.33%(羟苯乙酯)，样品溶液 RSD 为 0.62%(利多卡因)、0.30%(羟苯乙酯)，表明对照品溶液和样品溶液至少在12 h内稳定。

2.7 样品测定结果 见表2。

表2 膀胱镜胶中利多卡因和羟苯乙酯测定结果(n=3) mg/L

3 讨论

3.1 流动相组成 实验中对流动相的组成进行了筛选，分别采用乙腈-水、乙腈-体积分数0.1%磷酸水溶液、甲醇-磷酸盐缓冲液、乙腈-磷酸盐缓冲液作为流动相。发现流动相pH值对2种被测成分出峰情况均有影响。酸性条件下，利多卡因峰拖尾严重，且出峰过快，而羟苯乙酯峰保留时间超过25 min，峰明显展宽;pH值提高后，利多卡因的峰形有改善，羟苯乙酯的保留时间缩短。经过优化有机相和缓冲盐的比例，采用1.3中的流动相配比，2成分峰形良好，分离度满足要求。

3.2 检测波长的选择 以流动相为空白对照，用紫外可见分光光度计分别对2成分在200～400 nm范围内进行了扫描，发现利多卡因在210 nm处吸光度最大，从210～260 nm吸光度逐渐下降;羟苯乙酯的最大吸收峰在256 nm，其他波长处吸光度较低。考虑到有机相为甲醇，选择220 nm为利多卡因的检测波长，256 nm为羟苯乙酯的检测波长。作者比较了分别使用单一波长(256或220 nm)对同一份对照品溶液进行测定后获取的2张色谱图，利多卡因峰在256 nm测定时峰高大约为220 nm时的1/20;羟苯乙酯峰在256 nm测定时峰高大约为220 nm时的2.5倍。为了使2成分均可获得最高的检测灵敏度，在分析过程中切换检测波长为相应被测物的检测波长。具体设置为:设置初始波长为256 nm直至羟苯乙酯出峰完全，然后将检测波长切换至220 nm测定利多卡因;待利多卡因测定完成后再将波长切回256 nm。

总之，作者建立了一种同时测定膀胱镜胶中利多卡因和羟苯乙酯含量的分析方法;该方法操作简便、准确、重复性好，样品溶液稳定，可用于该类产品的质量控制。

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