KLK14基因沉默对OVCAR-3细胞凋亡和迁移能力的影响*

张瑞涛，史惠蓉，任 芳，陈志敏，贾艳艳，冯 巍

郑州大学第一附属医院妇科 郑州 450052

人组织激肽释放酶(kallikrein-related peptidase，KLK)家族包含15种结构同源的丝氨酸激酶，其基因定位于染色体19q13.4，在调节细胞生长和组织重构等一系列生理过程中发挥重要作用[1-2]。KLK14又称类组织激肽释放酶6，具有胰岛素样和糜蛋白酶样双重作用，能降解胶原Ⅳ等细胞外基质，可能与肿瘤的生长、转移和浸润等有关[3]。研究[4]表明，KLK14在卵巢癌和乳癌等多种上皮性肿瘤组织中异常高表达。作者采用RNA干扰技术抑制KLK14在人卵巢癌OVCAR-3细胞中的表达，观察其对细胞凋亡和迁移的影响，初步探讨KLK14与卵巢癌细胞恶性生物学行为的关系及可能机制。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂 人卵巢癌 SK-OV-3、OVCAR-3和HO-8910细胞系购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，预实验中已证实KLK14基因和蛋白在OVCAR-3细胞中的表达均高于SK-OV-3和 HO-8910细胞，故选用OVCAR-3细胞为后续实验细胞。Trizol购自美国Invitrogen公司。cDNA第一链合成试剂盒为加拿大Fermentas公司产品，2×Taq Master Mix为上海莱枫生物公司产品。应用Primer Premier 5.0软件设计PCR引物序列，交上海生物工程公司合成。TUNEL试剂盒购自德国Roche公司，8 μm Transwell小室购自美国Millipore公司。KLK14 shRNA质粒、control shRNA质粒、Transfection Reagent、山羊抗人KLK14多克隆抗体、鼠抗人MMP2单克隆抗体和鼠抗人MMP9单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。鼠抗人β-actin、鼠抗人Caspase-3和鼠抗人Caspase-9单克隆抗体、IP及WB蛋白提取液、ECL发光试剂盒均购自江苏碧云天公司。

1.2 细胞培养和转染 OVCAR-3细胞培养于含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的DMEM完全培养基中，取对数生长期细胞用于实验。按照Transfection Reagent说明书进行细胞转染:转染前1 d，换取不含抗生素的新鲜培养基后调整OVCAR-3细胞密度为2×105mL－1，以每孔2 mL接种于6孔板中培养过夜，待细胞50% ～70%融合时，分为3组，实验组和对照组更换为新鲜配制的含KLK14 shRNA或对照shRNA的无抗生素、无血清培养基，空白组仅加入同种培养基。孵育6 h后加入体积分数20%的完全培养基，继续培养18～24 h后用于后续实验。

1.3 RT-PCR Trizol提取细胞总 RNA，逆转录为cDNA。KLK14上游引物 5'-ACGCACCCCAACTA CAACTC-3'，下游引物 5'-GAACTCCTGCACAGAC CATG-3'(283 bp);β-actin上游引物 5'-ACGCAC CCCAACTACAACTC-3'，下游引物 5'-TCTCCTTAAT GTCACGCACGA-3'(372 bp)。PCR反应体系:模板cDNA 1 μL，2 × Taq Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各 1 μL，无 RNase H2O 定容至 25 μL。RT-PCR反应条件:94℃预变性3 min;94℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环;72℃终延伸5 min。PCR产物行20 g/L琼脂糖凝胶(混有EB)电泳，Image-Pro Plus 6.0系统采集、分析图像，以KLK14/β-actin比值表示目的基因的相对表达量，实验重复3次。

1.4 TUNEL实验 在载玻片上滴加单细胞悬液，培养4～6 h至细胞贴壁后，以40 g/L多聚甲醛固定30 min，体积分数0.3%过氧化氢甲醇阻断30 min，体积分数0.1%Triton X-100孵育2 min，然后按TUNEL试剂盒说明书处理细胞，DAB染色后封片，高倍镜下选取5个视野，每个视野计数每100个细胞中凋亡小体的数目，取均数，计算凋亡率。实验重复3次。

1.5 细胞迁移实验 制备细胞悬液，调整细胞密度至5×104mL－1，每组设3个孔，Transwell小室上室加入细胞悬液，200 μL/孔，下室加入含体积分数20%血清的培养基，500 μL/孔，培养6 h后甲醇固定5 min，苏木素染色30 min。擦去上室细胞后倒置小室，倒置显微镜下选取5个高倍视野计数迁移细胞后取均数。实验重复3次。

1.6 Western blot 收集细胞，IP及WB蛋白提取液提取细胞总蛋白，各取40 μg总蛋白进行100 g/L SDS-PAGE电泳，20 V恒压半干转至PVDF膜，用含50 g/L脱脂奶粉的TBST 4℃封闭过夜，分别用KLK14抗体(按 1∶500稀释)、β-actin抗体(按1∶400稀释)、Caspase-3(按1∶500稀释)、Caspase-9(按1∶1000稀释)、MMP2(按1∶600稀释)和MMP9(按1∶600稀释)室温孵育1.5 h。二抗采用辣根过氧化物酶标记的相应IgG(按1∶5000稀释)，室温孵育1.5 h，ECL发光试剂盒处理后曝光。Image-Pro Plus 6.0系统采集、分析图像，以目的蛋白/β-actin的比值表示目的蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.7 统计学处理 使用SPSS 17.0处理数据。采用单因素方差分析比较空白组、对照组和实验组OVCAR-3细胞中KLK14 mRNA与蛋白及 Caspase-3、Caspase-9、MMP2和MMP9蛋白表达的差异以及细胞凋亡率和迁移细胞数的差异，组间两两比较采用 Bonferroni检验，检验水准 α =0.05。

2 结果

2.1 3组细胞中KLK14 mRNA和蛋白的表达见图1、表1。

2.2 3组细胞凋亡率比较 空白组、对照组和实验组OVCAR-3细胞的凋亡率分别为(4.7±2.1)%、(7.3 ±2.1)%和(30.3 ±2.9)%，实验组 OVCAR-3细胞的凋亡率明显高于其他2组细胞(F=54.313，P ＜0.001)，见图2。

图1 3组细胞中KLK14 mRNA和蛋白的表达

表1 3组OVCAR-3细胞中KLK14 mRNA及蛋白的表达

2.3 3组细胞迁移能力比较 空白组、对照组和实验组OVCAR-3迁移细胞数分别为(67.7±2.5)、(66.0 ±5.3)和(29.7 ±3.8)个，实验组 OVCAR-3细胞迁移能力低于其他2组(F=85.283，P=0.013)，见图3。

2.4 3 组细胞中 Caspase-3、Caspase-9、MMP2 和MMP9蛋白的表达比较 见图4、表2。

图2 3组细胞的凋亡情况(DAB，×400)

图3 3组细胞的迁移情况(苏木素，×400)

图4 3组细胞中Caspase-3、Caspase-9、MMP2和MMP9蛋白的表达

表2 3组OVCAR-3细胞中Caspase-3、Caspase-9、MMP2和 MMP9蛋白的表达

3 讨论

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，近年来其死亡率高居妇科恶性肿瘤之首[5]。作者所在的课题组的前期研究[6-7]显示，卵巢上皮性癌组织中存在KLK14的高表达，KLK14的异常表达可能与卵巢癌的发生发展密切相关。KLK14基因在多种恶性肿瘤组织和肿瘤细胞系中存在异常表达，例如乳腺、卵巢、前列腺、睾丸、肺、结肠、唾液腺等部位的恶性肿瘤组织，并与相关肿瘤的发生发展及疾病的预后有密切关系[8-14]。

在恶性肿瘤的发病中抵抗程序性细胞死亡以及侵袭和转移能力的激活是大多数恶性肿瘤细胞生理学特点的重要共性改变[15]。目前，KLK14基因与卵巢癌细胞凋亡和迁移的关系尚不清楚。

该研究中作者采用KLK14shRNA转染OVCAR-3细胞后，OVCAR-3细胞中 KLK14 mRNA及蛋白的表达明显降低，细胞凋亡率升高，迁移能力受抑。此外，该研究结果还显示，转染KLK14 shRNA的OVCAR-3细胞中凋亡相关基因caspase-3和caspase-9的表达明显增加，与细胞侵袭和迁移性能相关的MMP2和MMP9蛋白的表达明显降低。上述结果亦印证了下调KLK14表达可抑制卵巢癌OVCAR-3细胞的恶性行为。

综上所述，KLK14基因受到抑制后可诱导细胞凋亡、抑制细胞的迁移能力;KLK14可作为卵巢癌治疗干预的目标。在此基础上进一步研究KLK14基因与卵巢癌的关系，有助于进一步阐明卵巢癌发病的分子机制，从而为卵巢癌的治疗干预提供新的分子生物学靶点。

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