抗阻训练对老龄大鼠腓肠肌Ca2+及线粒体膜电位的影响*

王 震，林文弢，翁锡全，孟 艳，蔺海旗

(1.广东青年职业学院，广东广州 510507;2.广州体育学院，广东广州 510500;3.华南理工大学体育学院，广东广州 510641)

线粒体是细胞氧化磷酸化的主要场所，为机体生命活动提供能量，贮存Ca2+、抗活性氧等重要生理作用。其功能异常、能量代谢障碍是引起细胞凋亡或坏死的原因之一。近年来，研究发现线粒体通透性转换孔(MPTP)是位于线粒体内外膜之间的一种复合体蛋白，其开放状态决定了线粒体膜电位(Δψm)的变化。人类和动物在衰老过程中，多数组织线粒体功能退化或出现障碍，导致Δψm下降，产生的过氧化物增加，ATP合成减少［1］。同时，线粒体胞浆内Ca2+浓度稳定性减弱，代谢功能异常，线粒体钙聚积，损害细胞的功能［2］。目前已有大量关于衰老与线粒体功能的报道，但有关抗阻训练对衰老机体线粒体Δψm变化报道较少。本文以18月龄雄性SD大鼠为研究对象，观察8周抗阻训练后老龄大鼠腓肠肌Ca2+、Δψm变化，探讨抗阻训练对老龄大鼠腓肠肌Δψm的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

11月龄健康雄性SD大鼠45只，体重600～1000g。购于广东省生物医学动物实验中心(许可证号:SCXK(粤)2008－0002)，分笼饲养，自由饮水，适量饮食(每笼每日90g)，室温23±2℃。湿度40% ～60%，自然昼夜节律变化光照，定时换垫料和饮水，保持通风。

1.2 实验方法

大鼠喂养7个月后，随机分为安静组、无负重训练组、30%最大负重训练组、50%最大负重训练组和70%最大负重训练组，每组8只。抗阻训练方式为尾巴负重跑台爬坡，坡度为35°，跑速15m/min。具体训练方案见表1。

表1 老龄大鼠抗阻力量训练方案

1.3 样品采集

抗阻训练完成后，大鼠均禁食约12h，称体重，10%水合氯醛300mg/kg.wt腹腔注射麻醉，剖腹取血，即刻取出腓肠肌用冷生理盐水漂洗去血液，滤纸吸干，用锡箔纸包裹，迅速置于液氮中，转放于－70℃冰箱保存。

1.4 评价指标

Ca2+采用比色法测试，比色仪器为721型分光光度计，试剂为南京建成生物研究所;线粒体Δψm采用JC－1脂质荧光染料法检测(线粒体膜电位检测试剂盒，批号:KGA603，规格:50T)，仪器为流式细胞仪(美国BD公司，BD FACSCalibur)，试剂为南京凯基生物科技发展有限公司。指标均由专人测试，严格按照试剂盒要求进行操作。

1.5 统计学分析

采用SPSS15.0统计软件包进行统计，实验数据以平均值±标准差表示。显著性差异采用one－way ANOVA检验，显著性水平为P＜0.05，极显著性水平为P＜0.01。

2 研究结果

2.1 8周抗阻训练对老龄大鼠腓肠肌胞浆Ca2+的影响

由表2可知，8周抗阻训练结束后，与安静组相比，4个抗阻训练组大鼠腓肠肌Ca2+降低，其中30%和50%最大负重训练两组有显著性下降(P＜0.05);与无负重训练组比较，30%、50%、70%最大负重训练三组的差异未见统计学意义(P＞0.05)。这说明抗阻训练可以不同程度降低老龄大鼠腓肠肌Ca2+，并以中、低强度抗阻训练的效果较好。

表2 安静组与各抗阻训练组大鼠腓肠肌Ca2+比较

2.2 8周抗阻训练对老龄大鼠腓肠肌线粒体Δψm的影响

由表3可知，8周抗阻训练结束后，与安静组相比，4个抗阻训练组大鼠腓肠肌线粒体ΔΨmt下降的细胞百分数出现不同程度的减少，其中无负重、30%、50%最大负重训练三组有极显著性减少(P＜0.01);与无负重训练组比较，30%最大负重训练组有显著性减少(P＜0.05)，而50%和70%最大负重训练两组无显著性变化(P＞0.05)。这说明抗阻训练可以不同程度减少老龄大鼠腓肠肌线粒体ΔΨmt下降的细胞百分数，并以中、低强度抗阻训练的效果较好。

表3 安静组与各抗阻训练组大鼠线粒体ΔΨmt下降的细胞百分数比较

图1 大鼠抗组训练腓肠肌线粒体ΔΨmt流式细胞检测

上图1各图右上象限为线粒体ΔΨmt正常的细胞百分数，而右下象限为线粒体ΔΨmt下降的细胞百分数。右下象限细胞百分数多，即线粒体膜电位下降的细胞数多，发生凋亡的细胞就增多。

3 分析与讨论

细胞凋亡的重要信号通路是线粒体，在细胞凋亡发展过程中起着决定性作用，是细胞存亡的关键因素。细胞内环境的变化，如活性氧、紫外线、Ca2+等的变化可使线粒体内外膜渗透性增加，ΔΨmt下降，促使促凋亡物质的释放，诱导细胞凋亡［3］。ΔΨmt与其功能状态密切相关，ΔΨmt下降是细胞凋亡的前兆［4］。ΔΨmt受MPTP的调控，MPTP是一种位于线粒体内外膜之间的复合型通道，MPTP孔开放程度的改变直接影响ΔΨmt的变化，MPTP开放ΔΨmt下降，反之依然［5］。目前无法直接检测MPTP开放程度，通过应用流式细胞仪进行检测ΔΨmt的变化，反映其开放程度［6］。JC－1是一种阳离子脂质荧光染料作为检测线粒体ΔΨmt指示剂，有单体和多聚体两种存在状态，在低浓度时以单体形式存在，高浓度时以多聚体形式存在，但均可在流式细胞仪绿色(FL－1)通道检测出绿色荧光，正常健康线粒体的ΔΨmt具有极性，JC－1以多聚体存在线粒体内且发射红色荧光，被流式细胞仪红色(FL－2)通道检测到，细胞发生凋亡时，线粒体ΔΨmt去极化，JC－1以单体形式存在与胞质内发绿色荧光。本研究采用跑台负重跑步方法作为抗阻训练研究其对老龄大鼠腓肠肌Ca2+及线粒体ΔΨmt的影响。结果显示，不同负重抗组训练可以降低老龄大鼠腓肠肌Ca2+及线粒体ΔΨmt下降的细胞百分率。

衰老过程中肌肉体积和质量逐渐下降，且随着年龄的增长下降有增加的趋势，导致肌肉萎缩。Song等［7］研究证实，细胞凋亡对衰老骨骼肌纤维的萎缩有影响。胞凋亡的重要通路是线粒体，其通路受多种因素的干预，例如Ca2+。Ca2+在细胞信号传导中起重要作用，细胞通过Ca2+浓度的变化调节生理功能［8］。细胞内Ca2+的稳定能保持细胞的正常功能。当细胞内Ca2+浓度变化时、线粒体主动摄取、释放、调节胞浆Ca2+浓度，维持细胞内的Ca2+稳态［9］。细胞内Ca2+增加可造成MPTP开放，从而引起Δψm下降甚至消失、造成细胞死亡［10］。细胞浆内Ca2+浓度过高，可刺激线粒体摄入Ca2+，导致线粒体内出现钙超载。Ca2+超载是引起 MPTP 开放［11］。He 等［12］发现，Ca2+能结合MPTP上的金属结合位点，使MPTP开放，细胞色素c释放，活化Caspase级链诱发细胞凋亡。上述研究表明:Ca2+变化与线粒体功能密切相关，是导致MPTP开放，ΔΨmt降低诱发细胞凋亡的原因之一。

有研究表明:大鼠游泳运动后线粒体内Ca2+浓度明显增多，肌细胞出现凋亡，证实运动后骨骼肌线粒体内Ca2+超载是肌细胞凋亡的诱因［13］。郑师陵等研究也得出了相似的结论［14］。还有研究得出长时间力竭运动或急性运动后，线粒体内Ca2+含量显著增加［15，16］，其氧化磷酸化过程遭到破坏，能量代谢中断，线粒体对胞浆Ca2+浓度的缓冲能力减弱，造成Ca2+紊乱。本实验结果显示:8周抗阻训练干预后，与衰老安静组相比，各抗阻训练组大鼠腓肠肌Ca2+出现不同程度的降低，其中30%和50%最大负重训练两组有显著性下降(P＜0.05);与0%最大负重训练组比较，30%、50%、70%最大负重训练组间的差异未见统计学意义(P＞0.05)。说明适宜负荷的抗阻训练能降低腓肠肌Ca2+含量。本实验对ΔΨmt测试结果也印证了这一结论。因为在本实验中各抗阻训练组大鼠ΔΨmt下降的细胞百分率也出现了不同程度的减少，与衰老安静组相比，0%、30%、50%最大负重训练三组有极显著性减少(P＜0.01);与0%最大负重训练组比较，30%最大负重训练组有显著性减少(P＜0.05)，而50%和70%最大负重训练两组间无显著性变化(P＞0.05)。说明经过8周抗阻训练能抑制老龄大鼠线粒体膜通透性升高和MPTP开放，从而抑制Δψm下降，维持线粒体的正常生理功能，且其效果与负荷强度有关。这提示:8周抗组训练能改善老龄大鼠骨骼肌代谢情况，降低腓肠肌胞浆Ca2+含量，相应的改善线粒体功能，提高Δψm。但与之对应的抗阻力训练组大鼠腓肠肌Ca2+显著性下降(P＜0.05)，而线粒体ΔΨmt下降的细胞百分率有极显著性减少(P＜0.01)，这也证实了Ca2+并非影响线粒体功能的唯一因素，比如活性氧、氧化应激、Bcl－2家族等。郑师陵等［17］通过大鼠游泳实验，结果表明运动后第一周细胞凋亡的比例最高，而伴随着ΔΨmt下降，第二周后显著升高，第三周后逐渐下降，但仍高于对照组。刘丽萍等［18］研究表明:随着游泳运动时间的延长，肝细胞ΔΨmt的变化为升高、恢复、再升高。这表明随着运动时间的延长，线粒体逐渐适应其运动强度，并且提高其功能。本实验不足之处是没有对老龄大鼠抗组训练第一周、第二周、第三周等后腓肠肌ΔΨmt的变化情况测试。程丽彩等［19］研究认为8周运动组肝细胞凋亡率显著升高，线粒体ΔΨmt降低;12周运动组肝细胞凋亡率升高，线粒体ΔΨmt升高。本实验测试结果表明，8周抗阻训练后运动组腓肠肌线粒体ΔΨmt升高的细胞百分率增加而不是降低，而12周的抗阻训练腓肠肌线粒体ΔΨmt升高的细胞百分率如何变化还不清楚，这与程丽彩等研究结果不同的原因可能是测试的组织和运动方案不同所致。王长青等［20］研究认为不同运动负荷对线粒体ΔΨmt的影响各异，运动引起线粒体ΔΨmt下降的同时可导致细胞凋亡。这提示运动对线粒体ΔΨmt变化的影响还有待进一步深入的研究。

4 结论

4.1 8周不同负重抗阻训练能不同程度降低老龄大鼠腓肠肌胞浆Ca2+含量，维持线粒体的正常生理功能，抑制MPTP开放。其中，低、中等负重抗阻训练效果较明显。

4.2 8周不同负重抗阻训练能不同程度提高老龄大鼠腓肠肌线粒体Δψm，改善线粒体功能。其中，低、中等负重抗阻训练效果较好。

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