紫贻贝中碱性磷酸酶动力学特性研究

黄振娥，于 贞

（1. 烟台欣和味达美食品有限公司，山东 烟台264000；2. 烟台大学，山东 烟台264005）

贝是一种世界性分布的沿岸底栖双壳类海洋动物，由于其分布广、活动性低、商业价值高、对污染物有较强的生物累积能力而备受关注，很多国家把贻贝和牡蛎等贝类作为海洋污染的指示生物，广泛应用于海洋污染的生物监测[1]。碱性磷酸酶（ALP）广泛存在于自然界中，它催化磷酸单脂的水解以及磷酸基团的转移反应，在生物体内的磷代谢过程中起着十分重要的作用。海洋环境被污染，导致酶的构象和活力发生改变，使得碱性磷酸酶成为生物响应逆境环境的重要标志之一，可以作为监测环境胁迫的生物指标[2-6]。本研究对紫贻贝中碱性磷酸酶进行提取制备，测定其活力，并研究温度、pH 值对其活性的影响及其酶促动力学特性，为贻贝及其生化指标作为污染指示生物的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用紫贻贝购于烟台大学水产品市场，将其清洗干净，冷冻备用。供试试剂有：硝基苯磷酸二钠（分析纯）、硫酸铵（分析纯）、三羟甲基氨基甲烷（实验室技术级）、牛血清蛋白（特级纯）、盐酸（分析纯）、考马斯亮蓝G-250（分析纯）。供试仪器有：721 可见光分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）、数控超级恒温槽（宁波天恒仪器厂）、HR2860 飞利浦搅拌机（珠海经济特区飞利浦家庭电器有限公司）、pH 计（梅特勒-托利多仪器有限公司）、GT10-2 高速台式离心机（北京时代北利离心机有限公司）、磁力搅拌器（深圳天南海北实业有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 酶的提取与测定 紫贻贝去壳，称重，按质量体积比1︰1.5（W︰V）分别加入预先冷却的0.01 mol/L Tris·HCl 缓冲液（pH 值5.5、6.5、7.5、8.5、9.0、9.5、10.0），匀浆，10 000 r/min 离心后，上清液加入磨细的硫酸铵粉末，至硫酸铵饱和度分别为40%，4℃静置沉淀4 h 以上，4 000 r/min 离心30 min，得到酶的粗提物。粗提物用0.01 mol/L Tris·HCl 缓冲液（pH 值与提取液相同）溶解，待测。采用磷酸苯二钠法[4]测定酶活，酶液在碱性条件下反应后，在405 nm 下测其OD 值。采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量[7]。酶的比活力（U/mg）＝酶活力（U/mL）÷蛋白质含量（mg/mL）。

1.2.2 碱性磷酸酶性质的研究（1）酶反应最适pH 值的确定。测定不同pH 值下的酶活力，以酶的比活力对相应的pH 值作图，求出碱性磷酸酶在此反应条件下的最适pH 值。（2）酶反应最适温度的确定。调节反应体系pH 值为9.0，在不同温度下测定酶活力，以酶活力对相应的温度作图，确定酶作用最适温度。（3）pH 值对酶反应稳定性的影响。用0.1 mol/L 不同pH 值的缓冲液配制0.1%的酶液，在4℃下静置处理30 min，然后调酶液pH 值为9.0，在37℃下测定酶活。以处理前的最初酶活力为100%，处理30 min 后的酶活力与其比值即为相对活力。（4）温度对酶反应稳定性的影响。酶液在不同温度下（30、40、50、60℃）保温0、15、30、45 和60 min 后，按常规方法测定酶活力，以处理前的最初酶活力为100%，保温（t）min 后的酶活力与其比值即为相对活力。以相对活力对时间t 作图，绘出温度稳定性曲线。（5）碱性磷酸酶动力学参数的确定。试验以对硝基苯磷酸二钠为底物，在pH 值9.0、温度37℃的条件下反应10 min，在405 nm处测定酶活，用L-B 作图法求Km和Vmax。

2 结果与讨论

2.1 碱性磷酸酶最适pH 值的确定

由图1 可知，在pH 值5.5～9.0 范围内，随着pH 值增大，酶的比活力缓慢上升，当pH 值为9.0 时，酶活力达到最大值；当pH 值高于9.0 时，酶的比活力急剧下降。因此，确定紫贻贝中碱性磷酸酶的最适pH 值为9.0。

图1 pH 值对碱性磷酸酶活力的影响

2.2 碱性磷酸酶的最适作用温度

由图2 可知，在30～37℃范围内，随着温度的提高，酶的比活力逐渐上升；在37℃时，酶的比活力达到最大值；高于此温度，酶的比活力迅速下降。因此，确定紫贻贝中碱性磷酸酶的最适作用温度为37℃。

图2 温度对碱性磷酸酶活力的影响

2.3 pH 值对碱性磷酸酶稳定性的影响

由图3 可知，碱性磷酸酶在酸性条件下不稳定，pH值为5.5 时，处理30 min 后，碱性磷酸酶活力丧失80%；随着pH 值的升高，碱性磷酸酶的稳定性逐渐增大；pH值在8.5～9.5 的范围内，碱性磷酸酶活力比较稳定；当pH 值大于9.5 后，碱性磷酸酶的稳定性又有所下降。

图3 pH 值对碱性磷酸酶稳定性的影响

2.4 温度对碱性磷酸酶稳定性的影响

由图4 可知，碱性磷酸酶在30～40℃时比较稳定，随保温时间的延长，酶相对活力的下降不明显；在50～60℃时，酶的热稳定性逐渐降低，随保温时间的延长，酶的相对活力呈下降趋势，且温度越高，酶稳定性越差，酶相对活力的下降趋势越明显，在60℃加热60 min后其酶活仍保留了47.5%。这说明该酶对热具有一定的耐受力。

图4 温度对碱性磷酸酶稳定性的影响

2.5 碱性磷酸酶动力学参数的确定

反应开始时对硝基苯磷酸二钠浓度分别为2、3、4、5、8、10 mmol/L，反应10 min 后，测定405 nm 吸光度，用L-B 作图法求米氏常数和最大反应速率，由图5 计算出碱性磷酸酶的米氏常数Km=0.09 mmol/L，rmax=0.22 mmol/(L·min)。

图5 L-B 作图法求碱性磷酸酶的动力学参数

3 结论

试验结果表明，碱性磷酸酶的最适作用pH 值为9.0，最适作用温度为37℃；碱性磷酸酶在pH 值5.5～7.5 的偏酸性范围内不稳定，而在pH 值8.5～9.5 的偏碱性范围内较稳定；碱性磷酸酶的稳定性随温度的增加而减弱，在60℃加热60 min 后其酶活仍保留47.5%，说明该酶对热具有一定的耐受力；37℃时碱性磷酸酶的动力学参数为：Km=0.09 mmol/L，rmax=0.22 mmol/（L·min）。

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