高脂肪饮食诱导多囊卵巢综合征表型改变的实验研究

倪倩倩，朱梦娇，姚根宏，王 勇

0 引 言

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是影响育龄妇女内分泌功能最常见的疾患之一，主要通过生殖、代谢以及心血管三方面影响患者的健康状况［1］。PCOS的发病机制尚未被具体阐释，初步研究显示遗传和环境两方面因素共同作用导致，其具体症状表现为卵巢类固醇的过度产生、促黄体生成素的分泌增加以及胰岛素抵抗等［2］。对PCOS患者的回顾性研究发现，肥胖和超重占67%，肥胖可通过胰岛素、瘦素及内源性大麻等系统在PCOS的病理过程中起重要作用，使PCOS的临床表现更加严重［3］。为了进一步研究肥胖与PCOS发病的关系，我们采用高脂饮食喂养雌性大鼠17周，成功诱发肥胖大鼠模型，然后研究大鼠性激素水平并分析卵巢形态，为进一步研究PCOS发病机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组 清洁级雌性Sprague Dawley(SD)大鼠20只，体重200～270 g，42日龄，由浙江省实验动物中心提供，合格证号:SCXK(浙)2008-0033。高脂饲料:5%糖，15%猪油，10%蛋黄粉，70%基础饲料;普通饲料:100%基础饲料。饲料由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供。

SD大鼠区组随机化分为2组:高脂组(高脂饲料喂养)13只，对照组(普通饲料喂养)7只。每笼1只，环境温度21～23℃，每天12 h光照(8:00至20:00)，实验中大鼠自由饮食、饮水。

1.2 造模方法与标本采集 2组大鼠适应性喂养3 d，然后以高脂饲料喂养高脂组大鼠，普通饲料喂养对照组大鼠，期间每天称重。2组大鼠在造模的第17周末晚开始禁食禁水。次日早晨称重。

1.3 糖耐量实验 采用德国罗氏诊断有限公司的血糖仪及试纸测定，基本步骤如下:将大鼠禁食禁水12h，次晨测取大鼠空腹血糖，然后将25%葡萄糖溶液按1 mL/100g体重腹腔注射注入大鼠体内，于注射后15、30、60、90、120、150min 通过尾静脉取血测量血糖值。

1.4 生化指标测定 大鼠喂养17周后，抽取腹主动脉血4～5 mL，全自动化生化分析检测血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白。

1.5 激素检测 采用睾酮(T)放射免疫分析试剂盒和胰岛素放射免疫试剂盒检测大鼠血清睾酮和空腹胰岛素水平。

1.6 卵巢形态学检测 大鼠喂养17周后，10%水合氯醛麻醉后处死。切取部分卵巢组织，常规石蜡包埋、切片以及HE染色。卵巢大体镜下诊断参照Mannerås 等［4］的标准。

1.7 统计学分析 统计分析采用SPSS 15.0软件，计量数据用均数±标准差()表示，组间数据比较采用方差分析，两个独立组比较采用t检验，方差不齐用Satterthwaite校正t检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 体重变化 每周称取实验大鼠体重直至第17周造模结束。在第17周末，高脂组大鼠体重平均增加(251.18 ±37.00)g，对照组大鼠体重平均增加(219.12 ±27.50)g，尽管组间比较差异无统计学意义上的差异，但从造模开始进行到第13周，高脂组大鼠的体重增重都显著高于对照组大鼠(P＜0.05)。从第13～17周，高脂组大鼠的体重在总体趋势上也是大于对照组。见图1。

图1 2组大鼠周体重变化Figure 1 Changes of body weight weekly in rats

2.2 空腹血糖及糖耐量 第17周末，禁食禁水12 h后测得2组大鼠的空腹血糖值，高脂组为(7.02±0.48)mmol/L，对照组为(6.00 ± 0.70)mmol/L，差异有统计学意义(P＜0.01)，见表1。腹腔注射25%葡萄糖溶液后 15、30、60、90、120、150 min 通过尾静脉取血测量血糖值，可看到高脂肪饮食组的大鼠的葡萄糖耐受水平低于正常饮食的大鼠，但差异无统计学意义(P＞0.05)。见图2。

2.3 脂肪代谢情况 脂肪代谢相关的生化检测结果显示，总胆固醇和低密度脂蛋白发生显著改变。高脂组的总胆固醇TC以及低密度脂蛋白都显著高于对照组(P＜0.05)，说明高脂组大鼠在脂肪代谢功能方面与对照组大鼠有所不同。

表1 大鼠空腹血糖及血清生化值比较()Table 1 Comparisons of fasting blood glucose and biochemical parameters in rats()

表1 大鼠空腹血糖及血清生化值比较()Table 1 Comparisons of fasting blood glucose and biochemical parameters in rats()

与对照组相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

项目 对照组(n=7) 高脂组(n=13)空腹血糖(mmol/L) 6.00 ±0.70 7.02 ±0.48＊＊谷丙转氨酶(U/L) 68.21 ±20.43 75.25 ±38.70谷草转氨酶(mmol/L) 317.19 ±139.89 266.33 ±124.56总胆固醇(mmol/L) 1.70 ±0.42 2.04 ±0.15*三酰甘油(mmol/L) 0.66 ±0.11 0.76 ±0.27高密度脂蛋白(mmol/L) 1.06 ±0.21 1.05 ±0.16低密度脂蛋白(mmol/L) 0.15 ±0.04 0.24 ±0.07＊＊

图2 大鼠葡萄糖耐量实验中血糖变化Figure 2 Changes of rats'blood glucose in glucose tolerance test

2.4 激素水平 ①大鼠血清激素水平:高脂组大鼠空腹胰岛素为(27.34 ±6.94)mU/L，对照组为(19.39 ±5.21)mU/L，差异有统计学意义(P ＜0.05)。②稳态模型胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment-insulin resistance，HOMA-IR):高脂组为0.00618 ±0.002 31，对照组为 0.008 21 ±0.00344。虽差异无统计学意义，但是数据显示高脂饮食的大鼠对胰岛素的敏感性低于普通饮食的大鼠。③雄激素水平:高脂组为(0.13±0.16)nmol/L，对照组为(0.04±0.03)nmol/L，显示高脂组大鼠较高的雄激素水平。

2.5 大鼠卵巢形态学变化 光镜下，对照组大鼠卵巢皮质可见不同发育时期的卵泡，黄体数量颇多，卵泡发育正常(图3a);细胞层次非常清晰，颗粒层细胞排列整齐、致密，7～8层，透明带完整，膜细胞层也排列完整，未见增生(图3b)。高脂组大鼠卵巢卵泡呈囊性扩张，镜下可见多个囊性卵泡，各级发育期卵泡以及黄体甚是少见，卵泡内未见卵母细胞(图3c)，放射冠、透明带消失，部分卵泡闭锁。闭锁卵泡内卵母细胞消失，颗粒细胞层及膜细胞层细胞排列松散紊乱，颗粒细胞层减少，2～3层，膜细胞层增厚，13～14层，层次不明显(图3d)。

图3 2组大鼠卵巢光镜下所见Figure 3 Ovarian slices of rats

3 讨 论

PCOS在育龄期妇女中的发病率为4%～18%，它对女性的生殖、代谢以及精神心理方面有很大影响，且加重女性患心血管病的风险［5］。其中，肥胖因素提高了 PCOS 的发病率［6］。De Groot等［7］总结近8年来的相关研究报道，在心血管疾病的发病妇女中，患有PCOS的妇女人数显著高于不患有PCOS的，而肥胖正是心血管疾病发病的高危影响因素。一些针对PCOS妇女的肥胖治疗的研究结果显示，PCOS患者体重减轻后症状也有所改善［8］。

现有研究显示，食物中大量脂肪的摄入易导致肥胖［9］。文献报道大鼠在摄入高脂肪食物后易导致体重增高等肥胖症状［10］。基于以上研究，为了进一步了解肥胖与PCOS的发病关系，我们通过建立雌性大鼠的肥胖模型来验证肥胖是否为PCOS发病的影响因素。参照文献［10-12］，我们以高脂饮食喂养雌性大鼠17周，将高脂组和对照组周体重增量进行对比，结果显示，高脂饮食下大鼠的体重比之正常饮食有显著增高。高脂组大鼠的空腹血糖、总胆固醇、低密度脂蛋白与对照组相比，均有很大差异。这些指标的改变与国外文献报道一致［10-12］，说明大鼠肥胖模型的建造成功。

根据2003年鹿特丹准则(Rotterdam Consensus)，PCOS的主要诊断标准之一为高雄激素血症，胰岛素抵抗为其次要诊断标准之一。本实验的激素检测结果显示，高脂饮食的大鼠雄激素水平和空腹胰岛素水平均显著高于正常饮食的大鼠，虽然胰岛素抵抗指数并没有统计学意义上的差异，但是仍然可以看出由于高脂饮食带来的大鼠内分泌激素水平的改变，这与国内目前李慧等［13］关于PCOS临床研究的生化指标相符。

卵巢形态学的改变也是PCOS的一项重要诊断依据。本实验高脂饮食大鼠的卵巢呈囊性扩张，镜下可见多个囊性卵泡，各级发育期卵泡以及黄体甚是少见，卵母细胞消失，颗粒细胞层和膜细胞层排列紊乱，颗粒细胞层数减少，膜细胞层增厚，层次不清。这些形态上的改变符合相关文献上关于PCOS大鼠模型的卵巢形态［14-15］。

以上的实验结果均显示了高脂饮食条件下，大鼠在一定程度上发生了PCOS的表型改变。总之，PCOS是多因素共同作用的结果，关于PCOS的具体发病机制，还没有明确的结论。本实验通过建造动物模型，证明了肥胖因素的重要性。本研究中模型的建立，为进一步探索肥胖与PCOS的发病关系以及具体的影响机制，为PCOS设计治疗方法、评估PCOS治疗效果提供基础。

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