双甲五灵胶囊抑制大鼠非酒精性脂肪性肝炎肝纤维化的研究

罗超，王平，徐贵森，沈才飞

（1.中国人民解放军成都军区总医院急诊科，成都 610083；2.中国人民解放军成都军区总医院消化内科，成都 610083）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，其发病与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关，病理学改变与酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）类似［1，2］。NAFLD 疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）和非酒精性脂肪性肝硬化3种主要类型，其中NASH是NAFLD进展的重要中间阶段［3，4］。

非酒精性脂肪性肝纤维化是NASH进展为肝硬化甚至肝癌的必经阶段，也是其进展为肝硬化的中间环节和限速步骤。因此，探寻有效抑制NASH肝纤维化的措施是NASH治疗的一个关键环节。近年来，中医药抗肝纤维化治疗研究已取得较多进展，部分已经进入临床应用阶段，如扶正化瘀319胶囊、复方861冲剂、复方鳖甲软肝片等［5］。双甲五灵胶囊是国内自主研发的一种抗肝纤维化治疗的中成药，其有效性已在长期临床实践中得到证实［6］。在本研究中，笔者利用大鼠模型探讨双甲五灵胶囊抑制NASH进展及抗纤维化作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及药品

健康雄性成年SD大鼠40只，体质量（200±20）g，由华西医科大学动物实验中心提供。双甲五灵胶囊购自第四军医大学唐都医院药剂科（其主要成分为柴胡、五味子、丹参、黄芪、灵芝、鳖甲、穿山甲等9味中药）。

1.2 NASH大鼠模型的构建

以每天25g/只 高脂饲料喂养构建NASH大鼠模型，其余大鼠以普通饲料补足，自由饮水。高脂饲料配方：猪油10%，胆固醇2%，基础饲料88%［7］。

1.3 动物分组及给药

将40只SD大鼠随机分为3组：1）正常大鼠对照组，10只，以正常饲料喂养；2）空白治疗模型组，15只，以高脂饲料喂养，不做其他处理；3）双甲五灵治疗组，15只，以高脂饲料喂养4w之后，同时喂养双甲五灵胶囊8w（平均2粒/d·只），实验共持续12w。期间大鼠自由进食进水，饲养于（20±2）℃明暗各12h的清洁级动物实验室。实验结束前夜禁食，麻醉状态下处死大鼠，称取大鼠体质量、肝湿重，常规制作血清标本及肝脏标本，保存于-80℃冰箱。

1.4 血清肝功能指标及肝组织TG含量检测

以日立SBA-300型全自动生化分析仪测量血清ALT、AST、TBIL、ALP及肝组织TG含量。

1.5 肝纤维化血清学指标的测定

采用放射免疫法测定血清透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）、Ⅳ胶原（Ⅳ-C）和Ⅲ型前胶原（PCⅢ），操作按照试剂盒说明书进行。

1.6 病理学诊断

肝组织切片后以天狼星红－苦味酸染色，光镜下观察大鼠肝组织胶原沉积情况，并以半定量计分系统（SSS）判断肝组织炎症活动度及纤维增生水平［8］。

1.7 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据处理，实验数据以均数±标准差（±s）表示，行studentt检验或ANOVA方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 双甲五灵胶囊治疗对大鼠体质量、肝湿重和肝TG含量等指标的影响

与正常大鼠对照组相比，空白治疗模型组大鼠体质量、肝湿重和肝TG含量均明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05），符合脂肪肝表现；与空白治疗模型组相比，双甲五灵治疗组大鼠体质量、肝湿重和肝TG含量则明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）（见表1）。

表1 大鼠体质量、肝湿重、肝TG含量等指标比较

2.2 双甲五灵胶囊治疗对大鼠肝功能指标的影响

与正常大鼠对照组相比，空白治疗模型组大鼠血清ALT、AST、TBIL及ALP均有显著增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；而造模大鼠在给予双甲五灵胶囊治疗后，其4项血清学指标均有显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）（见表2）。

表2 肝功能指标比较

2.3 肝纤维化血清学指标的变化

双甲五灵胶囊治疗对大鼠肝纤维化血清学指标的影响结果显示：与正常大鼠对照组相比，空白治疗模型组大鼠肝纤维化血清学指标HA、LN、Ⅳ-C及PCⅢ均有显著增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；但在给予双甲五灵胶囊治疗的造模大鼠中，肝纤维化血清学4项指标均有显著下调，差异有统计学意义（P＜0.05）（见表3）。

表3 肝纤维化血清学指标比较

2.4 肝纤维化病理学指标

为了进一步在病理学上明确双甲五灵胶囊治疗对NASH大鼠肝纤维化的抑制作用，笔者在实验终点取所有大鼠肝脏组织并以天狼星红－苦味酸染色法观察肝组织病理形态学变化，结果显示：与正常对照组大鼠相比，模型组大鼠正常肝小叶结构破坏，存在大量纤维结缔组织增生；与空白治疗模型组相比，双甲五灵治疗组肝组织纤维增生程度显著减轻（见图1）。根据SSS计分，双甲五灵治疗组大鼠炎症活动度及纤维化程度在统计学上也显著低于空白治疗模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），但较正常大鼠对照组，其炎症活动度及纤维化程度SSS计分仍较高，差异有统计学意义（P＜0.05）（见表4）。

图1 肝组织病理形态学变化（天狼星红－苦味酸染色法）

表4 炎症活动度及纤维化程度SSS计分的比较

3 讨论

随着肥胖及其相关代谢综合征全球化的流行趋势，NAFLD现已成为欧美等发达国家主要的慢性肝病，普通成人NAFLD患病率为10%～30%，其中10%～20%为NASH，后者10年内发生肝硬化的概率高达25%。随着人民生活富裕程度的提高，我国肥胖人群愈来愈庞大。流行病学调查显示，在肥胖人群中，NAFLD发病率在50%以上。因此，NAFLD的防治已成为我国一个重大公共健康问题［9］。NASH是NAFLD发病过程中的关键环节，若不加控制，其将向肝纤维化及肝硬化发展。因此，控制NASH患者的肝纤维化过程尤为重要。

祖国传统医学应用活血化瘀原理治疗肝硬化已经取得了较好的效果，提示某些中药成份具有抗纤维化作用，如黄芪、丹参等［10，11］。临床研究表明，长期使用活血化瘀药物，可以有效阻止肝纤维化的进展。双甲五灵胶囊是在五灵丸活血化瘀基础上辅以软肝散结之中药而成，其主要成份包括柴胡、黄芪、丹参、灵芝、五味子、鳖甲、穿山甲等，实验室及多年临床实践表明，双甲五灵胶囊是一种有效的抗肝纤维化的中成药物［6，12，13］。

在本研究中，笔者初步探讨了双甲五灵胶囊对NASH大鼠肝纤维化进程的抑制作用，结果显示：双甲五灵胶囊可以在大体、肝功能指标、肝纤维化血清学指标、肝纤维化病理学指标如炎症活动度及纤维化程度等多个层次改善NASH大鼠肝纤维化的进程。这一结果提示：双甲五灵胶囊对肝纤维化的抑制作用不仅仅局限于病毒性肝炎由于炎症坏死所致的肝纤维化，其也可以应用于NASH由于游离脂肪酸等有毒物质导致的肝纤维化。虽然笔者的研究显示双甲五灵胶囊并不能完全抑制NASH的肝纤维化进程，但若联合应用饮食治疗、运动治疗、行为修正治疗或其他药物治疗等综合措施，可能会取得更好的治疗效果。双甲五灵胶囊抑制NASH大鼠肝纤维化进程的机制目前尚不明确，笔者下一步拟在双甲五灵胶囊对NASH大鼠肝星状细胞活化、胶原蛋白的生成与降解平衡、过氧化物清除及氧化应激损伤等多个方面进行探讨，以期能从循证医学的角度证实双甲五灵胶囊在NASH治疗中的作用，为祖国传统医学的发展做出贡献。

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