不同期别卵巢上皮性癌组织中结肠癌转移相关基因1表达

张瑞涛，任 芳，史惠蓉

郑州大学第一附属医院妇产科，郑州 450052

·论 著·

不同期别卵巢上皮性癌组织中结肠癌转移相关基因1表达

张瑞涛，任 芳，史惠蓉

郑州大学第一附属医院妇产科，郑州 450052

目的研究结肠癌转移相关基因1(MACC1)在不同期别卵巢上皮性癌组织中的表达情况及其与患者预后的关系。方法选取郑州大学第一附属医院妇产科2008年5月至2010年8月住院的卵巢上皮性癌患者52例，采用RT-PCR和Western blot法检测这些患者原发病灶组织样本中的MACC1 mRNA和蛋白表达，比较不同临床分期患者组织中的MACC1表达水平，采用Kaplan-Meier法分析MACC1表达与卵巢癌患者预后的关系。结果MACC1 mRNA在Ⅰ～Ⅳ期卵巢癌样本中的相对表达量分别为0．72 ±0．01、0．75 ±0．01、0．78 ±0．01 和0．81 ±0．02，差异有统计学意义(F=51．305，P=0．000);MACC1 蛋白在Ⅰ ～Ⅳ期卵巢癌样本中的相对表达量分别为0．71 ±0．04、0．73 ±0．02、0．76 ±0．01 和0．84 ±0．05，差异有统计学意义 (F=65．142，P=0．000)。截至2012年12月随访结束，Ⅲ～Ⅳ期中复发及死亡患者组织样本中MACC1蛋白的相对表达量显著高于病情稳定患者 (0．85±0．03比0．74±0．05，F=72．324，P=0．000)。相对于 MACC1表达较低的Ⅰ～Ⅱ期患者，MACC1表达较高的Ⅲ～Ⅳ期患者的生存时间明显缩短 (χ2=29．804，P=0．000)。结论

MACC1表达增加可能提示卵巢上皮性癌患者预后不良，MACC1可作为晚期卵巢上皮性癌的标志物。

结肠癌转移相关基因1;卵巢上皮性癌;临床分期;预后

Acta Acad Med Sin，2014，36(1)：47-51

结肠癌转移相关基因1(metastasis-associated in colon cancer-1，MACC1)是新发现的结肠癌转移相关标志物，可用于结肠癌转移和预后判断［1-2］。目前研究显示，MACC1基因与胃癌、肝癌等多种恶性肿瘤的侵袭和转移密切相关，具有作为恶性肿瘤临床治疗靶点和预后评估指标的潜在价值［3-4］。本课题组前期研究显示，卵巢上皮性癌组织中存在MACC1异常高表达，可能与卵巢上皮性癌的发生发展关系密切［5］。本研究分析了MACC1在不同期别卵巢上皮性癌组织中的表达情况及其与患者预后的关系，以期为研究MACC1与卵巢癌侵袭和转移的关系及其分子机制提供基础。

材料和方法

组织标本和临床资料郑州大学第一附属医院妇产科2008年5月至2010年8月住院的初诊卵巢上皮性癌患者52例，手术切除原发病灶组织样本。患者年龄21～75岁，中位年龄53岁;组织学分级：G1级10例，G2级14例，G3级28例;临床分期［6］：Ⅰ期5例，Ⅱ期11例，Ⅲ期24例，Ⅳ期12例 (其中腹壁皮下脂肪转移灶3例，术中探查为腹膜后非淋巴结转移灶4例，肝实质微小占位、术后病变扩大穿刺活检病理证实为转移5例);组织学类型：浆液性癌30例，黏液性癌22例;有淋巴结转移者20例 (其中仅盆腔淋巴结转移者11例，仅腹主动脉旁淋巴结转移者4例，两处淋巴结均存在转移者5例)，无淋巴结转移者32例。所有组织样本的收集和用途均获得患者知情同意，并经郑州大学道德伦理委员会批准。入选患者术后均接受规范化疗 (紫杉醇类联合铂类)，耐药的复发患者采用二线化疗药物联合化疗。

主要试剂Trizol为美国Invitrogen公司产品，RevertAid first strand cDNA合成试剂盒为加拿大Fermentas公司产品，2×Taq Master Mix为上海莱枫生物技术有限公司产品，Western及IP蛋白裂解液、预染蛋白质Marker购自江苏碧云天生物公司，兔抗人MACC1多克隆抗体为美国Sigma公司产品，电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)试剂盒、兔抗人βactin单克隆抗体、鼠抗兔单克隆IgG均购自北京中杉金桥科技有限公司。

RT-PCR采用Trizol提取组织总RNA，参照RevertAid first strand cDNA合成试剂盒说明书反转录合成cDNA模板。RT-PCR所用引物由上海生物工程有限公司设计合成，引物序列见表1，PCR反应体系为：cDNA模板 1 μl、2 × Taq Master Mix 11 μl、正向引物1 μl、反向引物 1 μl、去 RNA 酶水 11 μl。反应条件为：94℃ 3 min;94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，30个循环;72℃ 5 min;4℃终止。应用Image-Pro Plus 6．0软件分析特异性目的条带的灰度值，将β-actin设为内参对照。

表1 RT-PCR所用引物序列Table 1 Primer sequences for RT-PCR

Western blot法 采用Western及IP蛋白裂解液提取组织样本总蛋白，Bradford法进行蛋白定量。分别取30 μg总蛋白进行10%SDS-PAGE电泳，恒压20V半干转至PVDF膜，5%脱脂奶粉TBST液室温封闭2 h，分别用 MACC1抗体 (1∶75)、β-actin抗体(1∶500)4℃孵育过夜，IgG(1∶2000) 室温孵育2 h。ECL试剂盒显色后曝光，采用Image Pro-Plus 6．0软件分析特异性目的条带的灰度值，将β-actin设为内参对照。

统计学处理 采用SPSS 17．0统计软件，数据以均数±标准差表示，不同期别卵巢上皮性癌组织中MACC1表达的差异比较采用单因素方差分析和Bonferroni分析，采用Kaplan-Meier法分析MACC1表达与卵巢上皮性癌患者预后的关系，P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

MACC1 mRNA在不同期别卵巢癌组织中的表达MACC1 mRNA在Ⅰ～Ⅳ期卵巢上皮性癌组织样本中的相对表达量分别为0．72 ±0．01、0．75 ±0．01、0．78 ±0．01 和0．81 ±0．02，差异有统计学意义 (F=51．305，P=0．000)，临床分期越晚，MACC1 mRNA表达越高(图1)。

MACC1蛋白在不同期别卵巢癌组织中的表达MACC1蛋白在Ⅰ～Ⅳ期卵巢上皮性癌组织样本中的相对表达量分别为0．71 ±0．04、0．73 ±0．02、0．76 ±0．01 和0．84 ±0．05，差异有统计学意义 (F=65．142，P=0．000)，临床分期越晚，MACC1蛋白表达越高 (图2)。

图1 MACC1 mRNA在不同期别卵巢上皮性癌组织中的表达Fig 1 Expressions of MACC1 mRNA in different stages of epithelial ovarian cancer

图2 MACC1蛋白在不同期别卵巢上皮性癌组织中的表达Fig 2 Expressions of MACC1 protein in different stages of epithelial ovarian cancer

MACC1蛋白表达与卵巢癌患者预后的关系截至2012年12月，入组患者随访时间为11～55个月，中位随访时间29个月，随访结束时45例存活，7例死亡 (表2)。

截至随访结束，早期 (Ⅰ～Ⅱ期)患者中复发患者组织样本中MACC1的蛋白表达量高于病情稳定患者，但差异无统计学意义 (0．73 ± 0．04 比 0．72 ±0．01，F=371．844，P=0．179);晚期 (Ⅲ～Ⅳ期) 患者中复发及死亡患者组织样本中的MACC1蛋白表达量显著高于病情稳定患者 (0．85 ±0．03 比 0．74 ±0．05，F=72．324，P=0．000)。晚期患者组织样本中的MACC1蛋白表达量高于早期患者，差异有统计学意义 (0．81±0．02比0．72 ±0．05，F=58．365，P=0．000)。与 MACC1 表达较低的早期患者比较，MACC1表达较高的晚期患者的生存时间明显缩短 ( χ2=29．804，P=0．000，图3)。

表2 52例卵巢上皮性癌患者术后随访情况Table 2 Follow-up information of 52 epithelial ovarian cancer patients after surgery

图3 MACC1蛋白表达与卵巢上皮性癌患者预后的关系Fig 3 Relationship between the expression of MACC1 protein and the prognosis of epithelial ovarian cancer patients

讨 论

近年来，随着手术和化疗水平的提高，卵巢癌的死亡率有所下降，早期患者的5年生存率为90%，但70%的卵巢癌患者发现时病情已至晚期而得不到有效治疗，而晚期患者的5年生存率甚至不足30%，目前其死亡率位居各类妇科恶性肿瘤之首［7］。卵巢癌发生发展的分子生物学机制目前仍不清楚，因此探索卵巢癌的发病机制，明确其分子生物学行为，探寻新的、有效的卵巢癌分子生物学诊断、治疗和预后监测标志物，是当前卵巢癌临床治疗和研究中亟待解决的严峻课题。

Stein等［1］采用全基因组表达分析技术首次在结肠癌原发灶和转移灶中发现了MACC1，其表达水平是预测结肠癌转移形成和无转移生存期的独立影响因素。MACC1可促进结肠癌细胞增殖、侵袭和肝细胞生长因子 (hepatocyte growth factor，HGF)诱导的播散，以及小鼠模型中肿瘤细胞的生长和转移，而MACC1突变的癌细胞 (SH3结构域或富含脯氨酸序列缺失)则无以上表现［1］。存在转移灶的结肠癌患者的组织样本中MACC1的表达显著高于无转移灶的患者;MACC1 mRNA表达水平较低的结肠癌患者5年生存率为80%，而表达水平较高的患者5年生存率仅为15%;MACC1预测结肠癌转移阳性和阴性的准确性分别为74%和80%，可作为判断结肠癌预后的独立标志物［8］。近来有研究显示MACC1与肺癌、乳腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤的转移和预后相关，可用于相应恶性肿瘤的预后判断和分析［9-11］。

侵袭和转移是卵巢上皮性癌最重要的恶性生物学特点，临床分期越晚，病变侵犯的部位越广泛，临床治疗效果越不理想，患者的预后越差。本课题的前期免疫组织化学结果显示，卵巢上皮性癌组织中存在MACC1异常高表达，其阳性率显著高于正常卵巢组织和良性卵巢上皮性肿瘤组织，且临床分期越晚、组织分化越差和伴随淋巴结转移的卵巢癌组织中MACC1的阳性率越高，提示MACC1的异常表达可能与卵巢癌的发生发展密切相关［5］。本研究中RT-PCR和Western blot结果显示，在不同期别的卵巢上皮性癌原发病灶组织样本中，患者的临床分期越晚，MACC1 mRNA和蛋白的表达水平越高，晚期 (Ⅲ～Ⅳ期)患者组织样本中MACC1的表达水平显著高于早期 (Ⅰ～Ⅱ期)患者，而晚期患者中复发和死亡患者组织样本中的MACC1表达水平明显高于病情稳定患者。此外，与MACC1表达较低的Ⅰ～Ⅱ期患者比较，MACC1表达较高的Ⅲ～Ⅳ期患者的生存时间明显缩短。上述结果表明，MACC1表达增加可能提示卵巢上皮性癌患者预后不良，可作为晚期卵巢上皮性癌的标志物。

综上，MACC1异常表达可能参与卵巢癌的发生发展，其表达增加可能提示卵巢上皮性癌患者预后不良，可作为晚期卵巢上皮性癌的标志物。进一步研究MACC1异常表达与卵巢癌的关系，有助于阐明卵巢癌发生发展的分子机制，为卵巢癌的临床治疗和预后评估提供新的方法。

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Expression of Metastasis-associated in Colon Cancer-1 in Different Stages of Epithelial Ovarian Cancer

ZHANG Rui-tao，REN Fang，SHI Hui-rong

Department of Obstetrics and Gynecology，First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China

SHI Hui-rong Tel：0371-67967072，E-mail：huirongshizzu@yahoo．com

ObjectiveTo investigate the expression of metastasis-associated in colon cancer-1(MACC1)in different International Federation of Gynecology and Obstetrics(FIGO)stages of epithelial ovarian cancer and its relationship with prognosis．MethodsBetween May 2008 and August 2010，52 epithelial ovarian cancer patients were selected from the Department of Obstetrics and Gynecology of the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University．Reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)and Western blotting were used to detect the expression of MACC1 mRNA and protein in the primary lesions of epithelial ovarian cancer patients，the levels of MACC1 in different stage patients were compared，and the relationship between expression of MACC1 and prognosis of ovarian cancer patients was analyzed by Kaplan-Meier analysis．ResultsThe relative expression levels of MACC1 mRNA in epithelial ovarian cancer fromⅠstage toⅣ stage were 0．72 ±0．01，0．75 ±0．01，0．78 ±0．01，and 0．81 ±0．02，respectively(F=51．305，P=0．000) ．The expression levels of MACC1 protein from Ⅰ stage to Ⅳ stage were0．71 ±0．04，0．73 ±0．02，0．76 ±0．01，and 0．84 ±0．05，respectively(F=65．142，P=0．000) ．At the end of the follow-up，the expression of MACC1 protein in recurrence and dead patients ofⅢ-Ⅳ stages was obviously higher than that in the patients with stable disease(0．85 ± 0．03 vs．0．74 ± 0．05，F=72．324，P=0．000)．Compared toⅠ-Ⅱstage patients with lower MACC1 expression，the survival time ofⅢ-Ⅳ stage patients with higher MACCC1 expression was significantly shorter( χ2=29．804，P=0．000)．Conclusions Increased expression of MACC1 may indicate poor prognosis of ovarian cancer patients．Therefore，MACC1 may be a potential biomarker for advanced ovarian cancer．

metastasis-associated in colon cancer-1;epithelial ovarian cancer;clinical stage;prognosis

史惠蓉 电话：0371-67967072，电子邮件：huirongshizzu@yahoo．com

R737．31

A

1000-503X(2014)01-0047-05

10．3881/j．issn．1000-503X．2014．01．009

河南省重点科技攻关计划项目 (122102310545)Supported by the Key Scientific and Technological Project of Henan Province(122102310545)

2013-05-17)