含HSV-TK基因及IL-18基因复制缺陷型腺病毒载体的构建和鉴定

徐春华 刘越 肖利民 邓圣泽 李东海

随着分子生物学及相关学科的发展，肿瘤的基因疗法倍受关注，其中自杀基因疗法显示了较好的应用前景，HSV-TK/GCV系统是目前研究较为广泛的自杀基因治疗系统，研究表明，单一基因治疗效果不佳，而自杀基因与免疫治疗相结合是研究发展的趋势，可增强旁杀伤作用和激发肿瘤局部的免疫反应[1-2]。所以为了研究腺病毒载体介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）与细胞因子白细胞介素-18（IL-18）基因联合应用对C6鼠脑胶质瘤细胞的治疗效果，本实验拟通过构建含TK及IL-18基因的重组腺病毒载体，为肿瘤的基因治疗提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 （1）细胞株与质粒：PVA腺病毒载体 pAdtrackCMV、pAdEasy-1、大肠杆菌 E.coli，293细胞。（2）试剂：限制性内切酶XbaI、Kpn、Pme I、EcoR I、ExTaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、DNA凝胶回收试剂盒、碱性磷酸酶CIAP、DNA提取试剂盒等均购自TaKaRa公司；胰蛋白酶，小牛血清，DMEM，Polybrene，DMSO为Sigma公司产品；脂质体LipofectamineTM2000、DNA Ladder：Invitrogen公 司 胶回收小量试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司；中量质粒提取试剂盒购自Omega公司。

1.2 方法 通过在NCBI上的检索，在Gene Bank数据库中获取基因IL-18、TK的全长序列，引物由ABI公司的Primer Express Software v 2.0设计，由invitrogen公司合成。扩增IL-18及TK基因，IL-18引物序列：上游：5’-cacGGTACCATGGCTGCTGAACCAGTAGAAG T-3’下游：5’-gcTCTAGACTAGTCTTCGTTTTGAACAG TGAA-3’，预计长度：582 bp；TK 引物序列：上游：5’-cacGGTACCATGAGCTGCATTAACCTGCCCAC-3’， 下游：5’-gcTCTAGATCAGTTGGCAGGGCTGCATTGCAG AATC-3’，预计长度：705 bp。经各自反应条件后，用0.8%琼脂糖凝胶电泳，回收DNA片段。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，铺琼脂板后，37 ℃生化培养箱内培养10~12 h。挑取含有目的基因的候选克隆，采用DNA重组技术，构建AdCMV-TK及AdCMV-IL-18。

1.3 AdCMV-TK与AdCMV-IL-18的PCR鉴定 分别将AdCMV-TK及AdCMV-IL-18重组腺病毒液2 mL感染80%融合的293细胞，待单层细胞大部分变圆但尚未脱落时收集细胞，反复冻融3次，取少许提取腺病毒DNA，进行PCR鉴定，并以一个目的基因不同的重组病毒为阳性对照，采用纯水作为阴性对照。鉴定引物：上游：5’-ACCAAGGAAATCGGCCTCTAT-3’，下游：5’-GCCATACCTCTAGGCTGGCTAT -3’，预计长度：115 bp；TK引物序列：上游：5’-TGCATTAACCTGCCCACTGT-3’，下游：5’-AAAACTGCCCCTCGTCGAT-3’，预计长度：298 bp。

1.4 制备并纯化高滴定度腺病毒 回合1：从初级转染溶胞产物放大：干冰/甲醇浴冷冻细胞，37 ℃水浴解冻循环4次以从细胞释放病毒。用清洁的溶胞产物进行下一回合的放大或-80 ℃保存。回合2和3：中等规模的放大后；原种储存于-80 ℃。OD260检测病毒滴度。测量OD260时，加15 μL病毒和15 μL空白溶液至100 μL TE/0.1%SDS，旋转30 s，离心5 min，测量。

2 结果

2.1 PCR扩增TK及IL-18基因产物的电泳结果 从图1中分析，扩增的条带与预期的大小相符，说明得到的正是目的条带（TK：705 bp；IL-18：582 bp）。

2.2 重组腺病毒TK及IL-18的PCR鉴定 PCR电泳显示特异性预计大小的片段，证明重组腺病毒含有TK基因及 IL-18基因，见图 2~3（TK：298 bp；IL-18：115 bp）。

图1 PCR扩增目的基因的琼脂糖凝胶电泳

图2 AdCMV-TK的PCR鉴定

图3 AdCMV-IL-18的PCR鉴定

2.3 病毒滴度的测定 测得重组腺病度滴度为：AdCMV-TK=1.28×109PFU/mL， AdCMV-IL-18=1.28×109PFU/mL。

3 讨论

在现代分子生物学和基因工程技术飞速发展的推动下，肿瘤的生物学治疗日益受到人们的重视，显示出良好的应用前景。基因治疗是生物学治疗的一个重要组成部分，有效的基因治疗依赖于外源基因在受体中高效、稳定的表达，而这在很大程度上取决于基因治疗所采用的载体系统，基因治疗多为病毒性载体，常见的病毒性载体如逆转录病毒、腺病毒、慢病毒等，而以腺病毒为载体的治疗在基因治疗研究中应用广泛[3-4]。

腺病毒是一种无包膜的线状双链DNA病毒，在体内疗法的基因转移中具有很大的优势[5-6]，由于其感染细胞时DNA不整合到宿主染色体上，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，制备容易，操作简单。腺病毒载体具有以下优点：（1）人类是腺病毒的自然宿主，因此较为安全；（2）靶细胞范围广，它不但能感染复制分裂细胞，也能感染非分裂细胞，并且能介导体内多种组织的基因转移，如肺、脑、神经系统等；（3）滴度高，可达1011~1012PFU/mL；（4）可在肠道内及呼吸道内繁殖，它的重组病毒可由静脉注射、肠道吸收或气管内滴注等多类方式给予，以达到有效的基因转移和治疗；（5）该载体没有包膜，不容易被其补体所灭活，可直接在体内使用[7-8]。但载体也有不足之处：（1）基因转移缺乏特异性；（2）载体是一种非整合载体，对于非分裂相细胞，其介导的基因转移可持续表达几个月，但对于增殖旺盛的细胞，要达到长期的基因表达，则需重复给予；（3）重复给予时机体可能产生免疫应答，影响基因表达和治疗效果。

神经胶质瘤是常见的神经系统原发恶性肿瘤，约占全部中枢神经系统肿瘤的45%~55%，传统的手术、放疗及化疗等联合治疗效果不理想，低级别胶质瘤患者平均生存3~5年，而高级别胶质瘤则为1~2年[8-10]。自杀基因治疗在胶质瘤的基因治疗中占有极为重要的地位，自杀基因疗法是指将某些病毒的基因转导入肿瘤细胞，此基因编码的特异性酶类能将细胞无毒或毒性极低的药物前体在肿瘤细胞内代谢成细胞毒性产物，以达到杀死肿瘤细胞为目的[11]。研究发现，只要少量的自杀基因转染的癌细胞与未转染的癌细胞按一定比例混合后共同培养，不仅转染的癌细胞被杀灭，二者相互接触后相邻的未转染的癌细胞也大量死亡，即“旁观者效应”[12-14]。但是自杀基因治疗不能有效地激发机体的抗肿瘤免疫反应，机体免疫反应是自杀基因旁观者效应的主要因素，免疫基因治疗虽可提高肿瘤细胞的免疫原性，诱导机体的抗肿瘤免疫应答，但直接杀伤肿瘤作用不强，因此可将自杀基因及免疫基因治疗联合应用以增强疗效[15]。

本实验为研究HSV-TK与IL-18基因联合应用对C6鼠脑胶质瘤细胞的抑瘤效果，进行了前期重组腺病毒的构建和鉴定工作，结果显示：通过采用腺病毒作为载体，经DNA重组技术，成功构建了重组腺病毒AdCMV-TK及AdCMV-IL-18，病毒滴度高，均为1.28×109PFU/mL，为今后肿瘤基因治疗的体内外进一步研究奠定了坚实的基础。

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