m ir-518d在妊娠期糖尿病患者胎盘中的表达及意义

常玉华，刘香坏，李坤

（1.山东省交通医院 妇产科，山东 济南 250031；2.山东省医学科学院附属医院 妇产科，山东 济南 250031）

m ir-518d在妊娠期糖尿病患者胎盘中的表达及意义

常玉华1，刘香坏1，李坤2

（1.山东省交通医院 妇产科，山东 济南 250031；2.山东省医学科学院附属医院 妇产科，山东 济南 250031）

目的探讨mir-518d在妊娠期糖尿病（gestational diabetesmellitus，GDM）患者胎盘中的表达及意义。方法选择山东省交通医院2013年1月～2013年12月间收治的行剖宫产分娩的GDM产妇30例作为GDM组，同期行剖宫产的正常产妇30例作为对照组。应用实时定量PCR检测胎盘和血清mir-518d的表达；应用ELISA法检测血清雌二醇水平；应用电化学发光法检测血清胰岛素水平。结果GDM组孕妇血清及胎盘mir-518d表达水平均显著高于对照组（P＜0.01）。应用Targetscan和miRanda基因预测软件发现过氧化物酶体增殖物活受体a（peroxisome proliferator activated receptor A，PPARa）基因存在1个mir-518d结合位点，推测PPARa是mir-518d的靶基因。GDM组孕妇血清雌二醇水平显著高于对照组（P＜0.05），血清胰岛素水平显著低于对照组（P＜0.01）。Pearson相关性分析显示，胎盘mir-518d的表达水平与血清雌二醇水平呈正相关（r＝0.686，P＝0.012），与血清胰岛素水平呈负相关（r＝－0.554，P＝0.020）。结论mir-518d可能通过调控PPARa基因影响机体糖代谢过程，在GDM发生发展中起到重要作用。

mir-518d；过氧化物酶体增殖物活受体a；妊娠期糖尿病

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择山东省交通医院2013年1月～2013年12月间收治的行剖宫产分娩的GDM产妇30例作为GDM组，诊断标准参照《妇产科学》第7版中GDM诊断标准［5］。年龄22～37岁，平均（28.1±3.2）岁，孕周36～42周，平均（38.4±0.8）周。选取同期行剖宫产的正常产妇30例作为对照组，年龄22～36岁，平均（27.7±3.2）岁，孕周36～42周，平均（38.8±0.7）周。所有受试者均排除高血压、糖尿病、肝肾疾病病史，并对实验研究知情同意，研究获医院伦理委员会批准。

1.2 主要实验试剂与仪器 RNAiso for Small RNA试剂盒购自日本TaKaR；mirNeasy kit购自德国Qiagen；Trizol试剂购自美国Invirogen；逆转录试剂盒、Taqman检测试剂盒、mir-518d特异性检测引物购自美国Applied Biosystem Inc。人雌激素酶联免疫吸附试剂盒，购自上海逸峰有限公司。主要实验仪器：Cobas e411电化学发光法胰岛素检测仪（Beckman公司，美国），BH13MD1600全自动生化分析仪（Beckman公司，美国）。

1.3 方法

1.3.1 标本采集及处理：在剖宫产后分别采集胎盘母体面中央处1 cm×1 cm×1 cm组织块，用干纱布吸干水分后液氮速冻低温保持。同时抽取孕妇外周静脉血10m L，5 000 r／min离心10min，取上清液放置－80℃冰箱中保存。

1.3.2 样品RNA提取：剪取100mg左右胎盘组织，加液氮研磨至粉末状，应用RNAiso for Small RNA进行提取，严格按照说明书步骤进行操作，最后加入50μL无RNA酶水解RNA，取1μL样品应用分光光度计测量RNA浓度，并将RNA溶液置于－80℃保存。取100μL血清，加入3倍体积 TRIzol室温放置15min，然后加入等体积氯仿，震荡50 s，室温放置15min，4℃下14 000 r／min高速离心，将水相转移15mL离心管中，加入1.5倍体积的无水乙醇，充分混匀后应用mirNeasy kit富集RNA，最后加入50μL无RNA酶水解RNA，取1μL样品应用分光光度计测量RNA浓度，并将RNA溶液置于－80℃保存。

1.3.3 实时定量PCR检测：应用TaqMan microRNA探针试剂和ABI7500荧光定量PCR仪进行逆转录和PCR扩增，先进行RNA逆转录获得 cDNA：16℃孵育30 min，42℃反应30 min，85℃孵育5min，获得cDNA。然后进行q-PCR反应：95℃循环5 min；95℃、15s，60℃、1min进行45个循环。mir-518d上游引物为5’-ACACTCCGGGCAAAGCGCTTCCCTT-3’，下游引物为 5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAAT-TCAGTTGAGCTCCAAA-3’，以U6作为内参。

1.3.4 PCR产物的检测：取PCR产物4μL加入1μL Buffer上样，电泳液用1×TBE，150 V电泳60min，紫外透射仪下观察PCR产物，个体 miRNAs表达水平以 2-ΔCt表示，ΔCt＝Ct样本-CtU6。

1.3.5 血清雌二醇及胰岛素检测：取血清2 mL，应用ELISA法检测血清雌二醇水平；另取血清2mL，应用电化学发光法检测血清胰岛素水平。严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.4 统计学方法 所有实验结果均重复3次，用SPSS 17.0软件进行统计学分析，正态计量数据用“±s”表示，计数资料比较应用t检验，应用Pearson相关性分析进行相关性分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组孕妇一般资料比较 2组孕妇年龄、孕周比较差异无统计学意义；GDM组孕妇BMI、新生儿体质量及胎盘重量显著高于对照组（P＜0.05，见表1）。

表1 2组孕妇一般资料比较Tab.1 Comparison of the basic data of pregnantwomen between two groups

2.2 2组孕妇血清及胎盘mir-518d表达结果 GDM组孕妇血清及胎盘mir-518d表达水平均显著高于对照组（P＜0.01，见表2）。

表2 2组孕妇血清及胎盘mir-518d的表达结果Tab.2 Expressions of serum and placentamir-518d of pregnantwomen in two groups

2.3 生物信息学预测mir-518d靶基因 应用Targetscan和miRanda基因预测软件发现过氧化物酶体增殖物活受体a（PPARa）基因存在1个mir-518d的结合位点，推测PPARa是mir-518d的靶基因（见图1）。

图1 mir－518d与PPARa基因结合模拟图Fig.1 The simulation figure ofmir－518d and PPARa gene combination

2.4 2组孕妇血清雌二醇及胰岛素水平比较 GDM组孕妇血清雌二醇水平显著高于对照组（P＜0.05），血清胰岛素水平显著低于对照组（P＜0.01，见表3）。

表3 2组孕妇血清雌二醇及胰岛素水平比较Tab.3 Camparison of serum estradiol and insulin levels of pregnantwomen in two groups

2.5 相关性分析 Pearson相关性分析显示，胎盘mir-518 d的表达水平与血清雌二醇水平呈正相关（r＝0.686，P＝0.012），与血清胰岛素水平呈负相关（r＝－0.554，P＝0.020）。

3 讨论

GDM是一种发病机制及其复杂的疾病，目前其病因和发病机制仍未完全明确。大量研究表明，GDM发病可能与遗传、免疫等因素有关［6-8］。近年来，随着分子生物学的发展，基因在GDM发病中的作用得到了人们的广泛关注，成为GDM的研究热点之一。miRNAs具有调节生物体生长、发育以及疾病发生中基因表达的功能［9］。已有研究证实miRNAs与糖尿病、妊娠期高血压疾病等的发病密切相关。Shi Z等［10］研究发现2型糖尿病模型大鼠应用雷米普利后出现多个miRNA表达差异，其中mir-518d可能通过转录水平参与胰腺功能调解。然而目前尚无妊娠期糖尿病孕妇胎盘中mir-518d表达的研究［11］。

本研究通过real-time PCR对GDM和正常孕妇胎盘及血清中mir-518d表达的检测发现：GDM组孕妇血清及胎盘mir-518d表达水平均显著高于对照组（P＜0.05）。提示mir-518d可能在GDM发病中起到重要的作用。应用Targetscan和miRanda基因预测软件进一步分析显示，PPARa基因存在1个mir-518d结合位点，推测PPARa是mir-518d靶基因。有研究报道，PPARa具有增强机体对胰岛素的敏感性，调节体内糖代谢等生物学功能［12］。另有研究报道 GDM胎盘中存在 PPARa的低表达［13］。因此笔者推测，mir-518d可能通过与PPARa的结合降低机体对胰岛素的敏感性，从而降低机体调节糖代谢的能力。

本研究还对2组孕妇血清雌二醇及胰岛素水平进行了检测，发现GDM组孕妇血清雌二醇水平显著高于对照组（P＜0.05），血清胰岛素水平显著低于对照组（P＜0.05）。而Pearson相关性分析显示，胎盘mir-518d的表达水平与血清雌二醇水平呈正相关（r＝0.686，P＝0.012），与血清胰岛素水平呈负相关（r＝－0.554，P＝0.020）。进一步提示mir-518 d可能通过某些信号转导通路促进孕妇雌二醇分泌，降低胰岛素分泌，从而影响GDM发病，其具体机制还有待于进一步研究。

综上所述，mir-518d可能通过调控PPARa基因影响机体糖代谢过程，在GDM发生发展中起到重要作用，而这一过程中伴随雌二醇及胰岛素的变化，对研究GDM的发病机制有重要意义。

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（编校：吴茜）

M ir-518d expression in placenta during pregnancy w ith diabetic patients and its significance

CHANG Yu-hua1，LIU Xiang-huan1，LIKun2

（1.Department of Obstetrics and Gynecology，Shandong Traffic Hospital，Ji'nan 250031，China；2.Department of Obstetrics and Gynecology，The Affiliated Hospital of Shandong Province Academy of Medical Sciences，Ji'nan 250031，China）

ObjectiveTo study the expression of mir-518d in placenta of pregnancy and mechanism in gestational diabetes mellitus（GDM）patients.Methods30 cases of GDM in Shandong Traffic Hospital from January 2013 to December 2013 who underwent cesarean delivery were selected as GDM group，30 cases of normal parturients underwent cesarean section as control group.Serum expressions ofmicro RNA-518 d were tested by realtime quantitative PCR， serum estradiol levels were detected by ELISA， and serum insulin level were detected by electrochemiluminescence.ResultsExpression ofmaternal serum and placentalmir-518d in GDM group were significantly higher than those in control group（P＜0.01）.Peroxisome proliferator activated receptor A（PPARa）gene had a mir-518d binding site predicted by Targetscan and miRanda gene prediction software.Pregnantwomen serum estradiol level of GDM group was significantly higher than that of control group（P＜0.05），serum insulin level was significantly lower than thatof control group（P＜0.01）.Pearson correlation analysis results showed that placentamir-518d levelwas positively related to serum estradiol level（r＝0.686，P＝0.012），and negatively correlated with serum insulin level（r＝－0.554，P＝0.020）.ConclusionMir-518 d may affect glucosemetabolism in the body process through regulating PPARa gene，and it plays an important role in the development of GDM.

mir-518d；peroxisome proliferator activated receptor A；gestational diabetesmellitus

R71

A

1005－1678（2014）05－0085－03

妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）是指妊娠期首次发生或发现的糖代谢异常，是产科常见的并发症，约占全部妊娠的5%～6%［1］。临床研究发现，GDM可以增加妊娠期高血压、自然流产、羊水过多等发生率，对母婴结局产生负面影响，临床应给予重视［2］。目前，对于GDM病因和发病机制仍未完全明确，研究GDM的发病机制，对于寻找新的诊断治疗方法具有重要的临床意义。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长19～23nt的非编码RNA分子，已有研究证实其与糖尿病、妊娠期高血压等的发病密切相关［3］。其中mir-518d家族位于人类19q染色体上，它随着妊娠的进展在母体中表达水平逐渐增高，与GDM发病可能有重要关系［4］。本文旨在探讨mir-518d在GDM患者胎盘中的表达及其作用机制。

山东省自然科学基金（ZR2009CL027）；济南市科技局科技明星计划（20100118）；山东省医学科学院医学基金（201023）

常玉华，女，本科，主治医师，研究方向：妇产科学，E-mail：13969106788＠139.com。