科罗索酸的抗肿瘤作用及其对CAM和YSM血管生成的影响

李标，林伟民，田树红，李凡，李富

（1.海南省农垦总局医院 胸外科，海南 海口 570311；2.海南医学院 安评中心，海南 海口 570100）

科罗索酸的抗肿瘤作用及其对CAM和YSM血管生成的影响

李标1，林伟民1，田树红2，李凡1，李富1

（1.海南省农垦总局医院 胸外科，海南 海口 570311；2.海南医学院 安评中心，海南 海口 570100）

目的探究科罗索酸（corosolic acid，CRA）的抗肿瘤作用及其对鸡胚绒毛尿囊膜（chick chorioallantoic membrane，CAM）和卵黄囊膜（yolk sacmembrane，YSM）血管生成的影响。方法MTT法检测CRA对肺癌细胞A549增殖的影响。将生物发光标记的人肺癌细胞A549接种到裸小鼠体内，建立生物发光标记的裸小鼠荷瘤模型，采用IVIS小动物活体成像系统检测小鼠体内肿瘤生长情况。采用鸡胚孵化实验，观察CRA对CAM和YSM血管生成的影响。结果CRA对A549增殖抑制的IC50值为26.8μg／mL。荷瘤动物试验结果表明：CRA对A549实体瘤有显著的抑制生长作用（P＜0.01）。在鸡胚孵化实验中，CRA可明显降低CAM和YSM血管生成。结论CRA对A549具有一定的治疗作用，其作用机制可能与抑制肿瘤组织中血管生成有关。

科罗索酸；A549；鸡胚绒毛尿囊膜；卵黄囊膜

肿瘤的血管生成在实体肿瘤的生长过程中起着关键性的作用，为肿瘤的生长提供营养，并为肿瘤的转移提供条件［1］。通常情况下，肿瘤组织的血管组织较为发达，因此，研发靶向抑制肿瘤血管组织的药物也具有较为广阔的应用前景。鸡胚绒毛尿囊膜和卵黄囊膜是体外研究药物对血管生成影响的常用方法［1-4］，具有操作简单和重复性好等特点［5-6］。本研究通过体外和体内抗肿瘤实验探讨科罗索酸（corosolic acid，CRA）对人肺癌细胞A549的抑制作用，及其对平皿中培养的鸡胚尿囊膜和卵黄囊膜血管生成的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与动物：人肺癌细胞A549，购自于中国科学院上海细胞库，委托上海乐晨生物科技有限公司进行生物发光标记。50只Balb／c裸小鼠，鼠龄4～5周，体重18～23 g。购于广东省医学实验动物中心，动物合格证号：SCXK（粤）2014-0003。

1.1.2 试剂与仪器：RPMI1640培养液和胎牛血清购于赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司，麻醉剂异氟烷购于河北九派制药有限公司。热电（上海）仪器有限公司生产的MK3酶标，精诺真的IVIS小动物活体成像系统，美国MATRX的VMR小动物专用吸入麻醉机，解剖显微镜带拍照系统。无菌干燥培养皿、滤纸片、75%（mL／mL）乙醇、种蛋等。

1.2 方法

1.2.1 体外抗肿瘤试验：MTT法检测科罗索酸对人肺癌细胞A549的体外抗肿瘤活性。采用RPMI-1640培养液培养A549细胞，37℃，5%CO2培养箱。取对数生长期细胞，用PBS清洗，胰蛋白酶消化并离心。接种于96孔板，37℃培养箱中继续培养。12 h后加入CRA，使其终质量浓度为分别分别为0、2、4、8mg／mL。24 h后，加入 5 mg／mL的 MTT溶液 20 uL，继续培养4 h，加入150 uL DMSO，酶标仪检测570 nm处的光密度值（OD值），计算 IC50。细胞增殖抑制率（%）＝（A空白对照组－ACRA组）／A空白对照组×100%。

1.2.2 体内抗肿瘤试验：①人肺癌细胞A549荷瘤动物模型的建立：50只SPF级健康的雌性裸小鼠，右侧颈背部皮下接种A549细胞悬液0.2mL，以IVIS小动物活体成像系统能检测到接种细胞作为造模成功标准。②IVIS小动物活体成像系统检测肿瘤细胞在小鼠体内的生长情况：取接种成功的裸小鼠40只，随机分为高剂量组、中剂量组、低剂量和模型组，每组10只。高、中、低给药组灌胃科罗索酸，给药剂量分别为8、4、2mg／mL；模型组给予生理盐水。所有裸小鼠每天给药1次，连续给药14 d。给药前和给药期间采用IVISKinetics小动物活体成像系统检测实体瘤生长情况。

1.2.3 鸡胚的孵育：将新鲜的受精鸡蛋用75%（mL／mL）酒精擦拭消毒后，气室朝上，与蛋托呈约45°角放入37.5℃孵化箱中孵化3 d。孵化箱内的相对湿度范围为50%～60%，每天转蛋3次。实验共分为科罗索酸高、中、低剂量组、阳性对照组和模型组。每组20只鸡蛋，共100只。

孵化第4天时，在净化工作台内用砂轮在蛋壳中间位置横向磨一道约2 cm长的切口，然后沿切口方向掰开蛋壳，将鸡胚移入无菌干燥的玻璃培养皿中，盖好盖子，放入孵化箱中继续孵育。孵育第7天，CAM直径长约10 mm，YSM血管直径长约15mm，用移液器将待测药物3μL加到滤纸片上，放置于CAM和YSM之间血管较少的部位，继续孵化24 h。然后，用解剖显微镜观察滤纸片周围CAM和YSM的血管密度和走向，并拍照。

2 结果

2.1 肿瘤抑制率 CRA质量浓度为 0、2、4、8mg／mL时，对应的 OD值为 2.153，1.82，1.167，0.404，抑制率分别为 0%，15.47%，45.8%，81.23%。体外实验结果表明，科罗索酸对肿瘤细胞株 A549的 IC50为26.8μg／mL。

2.2 CRA对A549实体瘤小鼠的治疗作用 对接种了A549肿瘤细胞的小鼠给予科罗索酸或生理盐水灌胃，14 d后活体成像检测小鼠实体瘤大小。结果显示给药科罗索酸后小鼠实体肿瘤明显小于模型组，说明一定浓度的科罗索酸能抑制荷瘤小鼠体内实体瘤的增长。其中，随着给药剂量的增加小鼠体内实体肿瘤的体积减小，特别是当给药剂量为8mg／kg时，实体肿瘤体积最小，表现出一定的量效关系。科罗索酸高剂量组给药后14 d肿瘤细胞数与给药前相比明显减少。溶媒对照组动物给药前与给药后14 d比较，可见肿瘤细胞数量增加明显（见图1、图2）。

图1 实验各组实体瘤给药前后生长情况＃P＜0.01，与各给药组相比；*P＜0.01，与其他两给药组相比Fig.1 Comparison of solid tumormass before and after dosing in four groups＃P＜0.01，compared with three CRA groups；*P＜0.01，compared with other two CRA groups

图2 高剂量科罗索酸（8mg／mL）给药前（a）和给药后（b）对裸鼠A549实体瘤生长的影响Fig.2 A549 tumor growth in nudemice before（a）and after（b）given high dose CRA（8mg／mL）for 14 days

2.3 CRA对鸡胚血管生成的影响 实验结果表明，药物作用鸡胚24 h后，溶媒对照组血管生长正常，主次血管清晰分明，新生血管丰富，血色正常。科罗索酸给药组（8mg／mL）与溶媒对照组比较，在含药液滤纸片下即周围CAM和YSM无血管生成或血管断裂消失（见图3）。

图3 CRA对CAM和YSM血管生成的影响Fig.3 Effect of CRA on the generation of CAM and YSM blood vessel

3 讨论

近年来研究表明，各种肿瘤特别是恶性肿瘤的发生发展与肿瘤组织中血管形成密切相关，肿瘤组织中血管的密度显著性的高于其他正常组织［7］，并且在癌症组织中相应的促血管生成因子表达也较高。袁捷等［8］研究认为在胃癌组织中相应的血管内皮细胞生长因子表达异常增高，并且癌症组织中微血管的密度相对于正常组织异常增高。因此近年来以肿瘤血管为目标的抗血管生成治疗肿瘤日益成为研究的热点，并且取得了显著的成果。如沙利度胺可通过抑制血管生成从而很好的抑制肿瘤生长［9］。在本研究中将肿瘤细胞株进行生物发光标记后植入小鼠体内，再用小动物活体成像系统进行检测。这样可以在无创伤的情况下时时定量检查小鼠体内肿瘤的生长情况，而且只有活细胞才会被检测到［10-11］。传统的体内抗肿瘤实验采用测量肿瘤的长径和短径来大致计算实体瘤的体积。这种方法误差较大，而且肿瘤组织的坏死部分也会因为无法判断而被忽略［12-14］。通过上述体内实验表明科罗索酸可以明显抑制小鼠实体肿瘤的增长，MTT实验结果表明科罗索酸能明显抑制人肺癌细胞A549的生长。体内外实验结果均表明科罗索酸有很好的抗肿瘤活性。

科罗索酸（corosolic acid，CRA），又名2α－羟基熊果酸，为一种天然的五环三萜酸。近年来研究表明科罗索酸具有抗炎和抗氧化应激的作用，也有研究表明科罗索酸对肿瘤细胞具有细胞毒性，其对肝癌细胞，胃癌细胞和乳腺癌细胞具有明显的抑制作用［15］。前期通过免疫组化方法初步分析了CRA对A549的抗肿瘤活性可能与影响肿瘤组织中血管生成有关。在本研究中采用传统的鸡胚平皿法［16］，考察科罗索酸对鸡胚CAM和YSM血管生成的影响，研究结果表明科罗索酸可显著抑制鸡胚CAM和YSM中血管生成，这一研究结果表明科罗索酸的抗肿瘤作用机制可能是通过抑制肿瘤中血管生成而实现的。

综上所述，科罗索酸具有良好的抗肿瘤的活性，能明显抑制CAM和YSM中血管生成，提示科罗索酸的抗肿瘤活性是通过抑制肿瘤中血管生成而实现的。

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（编校：吴茜）

Antitumor effect of corosolic acid and it's impact on CAM and YSM angiogenesis

LIBiao1，LINWei-ming1，TIAN Shu-hong2，LIFan1，LIFu1

（1.Department of thoracic surgery，Hainan Province Nongken Hospital，Haikou 570311，China；2.Safety Evaluation Center，Hainan Medical College Haikou 570100，China）

ObjectiveTo evaluate the antitumor effect of corosolic acid and its impact on CAM and YSM angiogenesis.MethodsThe effects of CRA on A549 proliferation was studied by MTTmethod in vitro.Tumor-bruden nude mice model were established by injecting A549 lung cancer cell marked with bioluminescent to nude mice，and the growth of tumor in mice were detected by IVIS small animal in vivo imaging system.Experiment of chicken embryos eggs are used to observe the role of drugs on CAM and YSM blood vessels.ResultsThe value of IC50of CRA for A549 in vitrowas26.8 μg／mL.A tumor-burdened animal experiment results showed that the CRA to A549 solid tumor has a certain therapeutic effect.CAM and YSM blood vessels of chicken embryos eggs treated with CRA were decreased significantly than negative control group.ConclusionCRA has certain therapeutic effect for A549，whichmay be related to the inhibition of angiogenesis in tumor tissues.

corosolic acid；A549；chick chorioallantoicmembrane；YSM

R734

A

1005－1678（2014）04－0022－03

海南省自然科学基金（813243）

李标，男，本科，副主仼医师，研究方向：肺癌临床及基础研究，E-mail：358342097＠qq.com。