转铁蛋白与RGD共修饰PLGA纳米粒的制备及其对黑色素瘤的靶向性研究

李宗祥，孙平

（华中农业大学医院，湖北 武汉 430070）

转铁蛋白与RGD共修饰PLGA纳米粒的制备及其对黑色素瘤的靶向性研究

李宗祥，孙平Δ

（华中农业大学医院，湖北 武汉 430070）

目的构建转铁蛋白（transferrin，TF）与RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，Arg-Gly-Asp）共修饰PLGA（聚乳酸羟基乙酸，poly（lactic-co-glycolic acid）纳米粒（TF／RGD-NPs），研究其黑色素瘤靶向性。方法采用乳化法制备TF和RGD共修饰纳米粒（TF／RGD-NPs），考察其形态、粒径、电位等理化性质。通过细胞摄取实验和黑色素瘤肿瘤球穿透实验考察TF／RGD-NPs与黑色素瘤B16细胞的亲和力和肿瘤组织穿透能力。结果制备的TF／RGD-NPs粒径为（113.4±12.5）nm，电位为（4.53±2.15）mV。体外细胞摄取实验表明B16细胞对TF／RGD-NPs的摄取效率分别是TF-NPs和RGD-NPs的2.7倍和2.9倍，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。细胞摄取实验和肿瘤球摄取实验结果表明TF／RGD-NPs具有良好的黑色素瘤细胞亲和力。结论转铁蛋白与RGD共修饰纳米粒具有良好的黑色素瘤靶向性，是一种潜在的黑色素瘤靶向给药系统。

转铁蛋白；RGD；PLGA纳米粒；黑色素瘤；药物靶向

1 材料与方法

1.1 材料 SizerNano ZS90型激光粒度仪及ZETA电位分析仪（英国Malvern instruments Ltd）。RGD peptide（上海强耀生物公司）；PLGA（聚乳酸羟基乙酸，山东省医疗器械研究所）；PLGA-PEG2000（美国Avanti polar lipids公司）；DMEM高糖培养基（美国 corning公司）；转铁蛋白（美国 sigma公司）；PLGA-PEG2000-MAL（美国sigma公司）；其余试剂为分析纯。鼠黑色素瘤细胞（B16，ATCC）。

1.2 方法

1.2.1 PLGA-PEG2000-TF和PLGA-PEG2000-RGD的合成：将适量转铁蛋白（transferrin，TF）和Traut's reagent置于小反应瓶中，加PBS缓冲液lmL溶解，室温，氩气下，反应3 h。反应产物过凝胶脱盐柱，得到TF-SH溶液。将TF-SH溶液缓慢滴加入PLGA-PEG2000-MAL溶液，室温，氩气下，反应24 h后冻干得到PLGA-PEG2000-TF。

参照Torchilin等［8］方法合成PLGA-PEG2000-RGD。将一定量商品化PLGA-PEG2000-Mal用适量氯仿溶于茄形瓶中，旋转蒸发除去溶剂成膜，真空干燥过夜。加入适量PBS缓冲液（pH 7.4）水化，水浴超声5min使形成均匀的PLGA-PEG-Mal胶束溶液。将RGD多肽溶液加入上述胶束溶液，N2保护下4℃搅拌反应直至TLC薄层色谱（展开剂甲醇∶二氯甲烷＝1∶10）观察到PLGA-PEG2000-Mal点基本消失。Sephadex-G50凝胶色谱柱分离PLGA-PEG2000-RGD和游离RGD，溶液后冻干，除去水液，氯仿溶解后过滤除去无机盐，重复操作2次得PLGA-PEG2000-RGD，减压抽去氯仿，得到产物。

1.2.2 转铁蛋白和RGD共修饰纳米粒的制备：取PLGAPEG2000-TF 9.55 mg，PLGA-PEG2000-RGD 5.45 mg和 PLGAPEG2000-OMe 5.25mg，共同溶于2mL丙酮，室温下缓慢滴加入不断搅拌中的5mL水中，搅拌2 h后，用旋转蒸发仪除去溶液中的有机溶剂，得到转铁蛋白和RGD共修饰的PLGA纳米粒。

1.2.3 细胞摄取实验：将处于对数生长期的B16细胞以5×105个／孔的密度接种于6孔板中，37℃培养24 h，分成 NPs组、TF-NPs组、RGD-NPs组和 TF／RGD-NPs组，每组分别加入适量相应载香豆素-6的纳米粒溶液，孔中香豆素-6的浓度为20 ng／mL。37℃分别孵育2、4 h后除去含纳米粒培养基，冷PBS清洗3次，0.25%胰酶消化后离心，再用PBS清洗3次，流式细胞仪检测细胞荧光值。另取相同组别纳米粒与细胞共同孵育4 h，PBS漂洗3次，加入2μg／mLDAPI溶液，室温孵育15min，再加冰PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定15min，弃去多聚甲醛，用冰PBS保存。置激光共聚焦显微镜观察细胞摄取情况。

1.2.4 肿瘤球穿透性实验：取对数生长期的B16细胞，0.125%胰酶消化，用含血清的培养基中和胰酶，并将细胞吹打下来后离心，弃去上清液。用培养基重悬细胞，接种于用低熔点琼脂糖预处理的96孔板，将96孔板移入37℃5%CO2孵箱中培养。7 d后成长为肿瘤球。按照“1.2.3”项下分组并给药，置激光共聚焦显微镜观察肿瘤球的荧光分布。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0进行数据分析，正态计量数据以“±s”表示，2组间比较用t检验，多组间比较用方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转铁蛋白与RGD共修饰PLGA纳米粒的表征 将TF／RGD-NPs用磷钨酸染色，透射电镜（TEM）下观察纳米粒形态：制备的纳米粒成球状，形态均一（见图1）。另取适量样品用粒度仪测定其粒径以及电位，测得纳米粒的粒径均＜200 nm，PDI＜0.3（见表1）。

图1 转铁蛋白与RGD共修饰纳米粒的透射电镜照片Fig.1 Transmission electron microscopy image of TF／RGD-NPs

表1 不同纳米粒的表征Tab.1 Characteristics of TF／RGD-NPs，RGD-NPs，TF-NPs and NPs

2.2 B16细胞对TF／RGD-NPs的摄取情况 定量体外细胞摄取实验表明：给药4 h后，B16细胞对TF／RGD-NPs的摄取效率分别是TF-NPs、RGD-NPs和NPs的2.7倍、2.9倍和4.3倍，差异均具有统计学意义（P＜0.01，见表2）。定性细胞摄取实验结果显示TF／RGD-NPs组的绿色荧光集中在被蓝色DAPI染色的细胞核周围，明显强于其他组（见表2）。与定量实验结果一致。

表2 B16细胞对不同纳米粒的摄取效率Tab.2 Uptake of different nanoparticles by B16 cells

图2 激光共聚焦观察B16细胞对载香豆素-6不同纳米粒的摄取情况（×200）Fig.2 Uptake of coumarin-6 loaded different nanoparticles by B16 cells based on confocal laser scanningmicroscopy（×200）

2.3 TF／RGD-NPs对B16细胞肿瘤球的穿透性 肿瘤球穿透实验结果表明：载香豆素-6的不同纳米粒与肿瘤球共孵育4 h后，TF／RGD-NPs组的荧光强度最强，TF-NPs和RGD-NPs次之，NPs最弱，与体外细胞摄取实验结果一致（见图3）。

图3 载香豆素-6纳米粒对B16细胞肿瘤球的穿透性Fig.3 Uptake of coumarin-6loadednanoparticles by B16 tumor spheroids

3 讨论

有研究证实，在黑色素瘤细胞表面存在高度表达的转铁蛋白受体及整合素受体［9-10］。转铁蛋白是一种小分子糖蛋白，它可与肿瘤细胞表面高度表达的转铁蛋白受体结合并在其介导下被细胞内吞入细胞内。将转铁蛋白连接在脂质体上以实现主动靶向治疗肿瘤已被广泛研究且取得了初步成效［10］。RGD能特异识别含αv亚基的整合素家族［11-12］，有研究证明具环状结构的RGD显示出与整合素 αvβ3、αvβ5的高度亲和力［13-15］。因此，本研究将转铁蛋白和RGD一起连接到PLGA纳米粒表面，考察修饰后的纳米粒对黑色素瘤细胞的靶向性。由于两种特异性小分子的选择性，既可以避免载药后对正常细胞的损伤，也可以利用2种配体的协同作用介导纳米粒高效进入肿瘤细胞。

本研究结果显示：B16细胞对TF／RGD-NPs的摄取效率分别是TF-NPs、RGD-NPs和NPs的2.7倍、2.9倍和4.3倍，说明转铁蛋白与RGD共修饰能够起到协同作用，促进纳米粒被肿瘤细胞所摄取。肿瘤球穿透实验结果显示：共修饰纳米粒比转铁蛋白和整合素受体RGD单独修饰的纳米粒具有更好的肿瘤组织穿透性。

综上所述，本研究构建的转铁蛋白与RGD共修饰纳米粒（RGD／TF-NPs）具有良好的黑色素瘤细胞靶向性，是一种潜在的黑色素瘤靶向给药系统。

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（编校：吴茜）

Preparation of transferrin and RGD co-modified PLGA nanoparticles and its targeting to melanoma

LIZong-xiang，SUN PingΔ

（Hospital of Central China Agricultural University，Wuhan 430070，China）

ObjectiveTo prepare transferrin and Arg-Gly-Asp polypeptide co-modified nanoparticles（TF／RGD-NPs）and evaluate its targeting efficiency tomelanoma.MethodsThe co-modified nanoparticleswere prepared by emulsion method and its appearance，particle size and Zeta potential were evaluated.The cellular uptake experiment and melanoma tumor spheroids penetration testwere used to evaluate the affinity and ability to penetrate tumor tissues of TF／RGD-NPs tomelanoma B16 cells.ResultsThe particle diameter of co-modified nanoparticleswas（113.4±12.5）nm and the Zeta potentialwas（4.53±2.15）mV.In vitro uptake testdemonstrated that the efficacy of cellular uptaken TF／RGD-NPsby B16 cellswere2.7 times and 2.9 times to TF-NPs and RGD-NPs，respectively，the differences were all significant（P＜0.05）.Tumor spheroid penetration test results showed that TF／RGD-NPs has good affinity to melanoma cells.ConclusionTF／RGD-NPs can target to melanoma B16 cell efficiency in vitro，itmay be serve as a potential drug delivery system for targetingmelanoma.

transferrin；RGD；PLGA nanoparticle；melanoma；drug targeting

R739.5

A

1005－1678（2014）04－0019－03

黑色素瘤是临床上一种常见的皮肤恶性肿瘤，其恶性程度高，临床预后差。尽管其发病率比较低，仅占全部恶性肿瘤的1%～3%，但是随着全球环境状况的恶化，恶性黑色素瘤的发病率在世界范围内呈上升趋势［1］。转铁蛋白受体是一种在正常细胞和肿瘤细胞表面都普遍存在的受体，但在肿瘤细胞的表面转铁蛋白受体的表达是正常细胞的4～5倍［2］。整合素（Integrins）是一类细胞黏附受体分子，在有核细胞表面均广泛表达，其中整合素αvβ3在卵巢癌、黑色素瘤、神经胶质瘤等多种肿瘤细胞表面高度表达，因此整合素αvβ3常被用作肿瘤靶向的特异性靶点［3-5］。已有研究表明，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）的三肽序列能够特异性地识别含αv亚基的整合素家族，具有高度亲和力［6-7］。本研究以经过FDA批准的高分子材料聚乳酸羟基乙酸［poly（lactic-co-glycolic acid，PLGA］为基础制备纳米粒，将转铁蛋白和RGD连接到纳米粒表面，对共修饰纳米粒的理化性质进行体外评价并对其黑色素瘤的靶向性进行研究。

国家自然科学基金（81171365）

李宗祥，男，本科，主治医师，研究方向：乳腺癌的基础与临床治疗，E-mail：lizongxiang1975＠163.com；孙平，通信作者，男，本科，主治医师，研究方向：肿瘤疾病的基础与临床治疗，E-mail：2094252562＠qq.com。