KA2012MBL复合提取液体外抗肿瘤活性评价及相关机制研究

2014-09-17 06:42易翠林时京杰王玉林
大连医科大学学报 2014年1期
关键词:细胞毒膜电位提取液

易翠林,时京杰,包 雪,王玉林

(1.大连活尔生物科技有限公司,辽宁大连 116023;2大连蓝德奥科技有限公司,辽宁大连 116023;3.大连医科大学基础医学院,辽宁大连 116044)

KA2012MBL复合提取液体外抗肿瘤活性评价及相关机制研究

易翠林1,时京杰2,包 雪3,王玉林3

(1.大连活尔生物科技有限公司,辽宁大连 116023;2大连蓝德奥科技有限公司,辽宁大连 116023;3.大连医科大学基础医学院,辽宁大连 116044)

目的 系统评价KA2012MBL复合提取液的抗肿瘤活性及对P-gp介导的肿瘤多药耐药的克服能力,并初步探讨KA2012MBL复合提取液的抗肿瘤机制。方法 应用SRB法测定KA2012MBL复合提取液对K562/A、K562/S和HGC-27的细胞毒活性,应用流式细胞术检测KA2012MBL复合提取液对K562/S细胞的细胞周期阻滞作用、凋亡诱导作用和对其线粒体膜电位的影响作用。结果 KA2012MBL复合提取液对肿瘤细胞株K562/A、K562/S和 HGC -27 均具有细胞毒活性,IC50值分别为(1.12±0.15)%(v/v%)、(1.18±0.04)%(v/v%)、(1.21 ±0.17)%(v/v%),并可有效克服P-gp介导的肿瘤多药耐药。流式细胞术检测结果显示KA2012MBL复合提取液可有效降低K562/S细胞的线粒体膜电位,并可使K562/S细胞阻滞在 G0/G1期,从而诱导其凋亡。结论KA2012MBL复合提取液通过诱导肿瘤细胞凋亡而杀死肿瘤细胞,同时能克服P-gp介导的肿瘤多药耐药。

细胞毒;肿瘤多药耐药;细胞周期;线粒体膜电位;细胞凋亡

肿瘤是危害人类健康的主要疾病之一,化疗是中晚期恶性肿瘤病人最常用的治疗方法。肿瘤细胞对抗肿瘤药物的多药耐药(multidrug-resistance,MDR)是导致化疗失败的主要原因[1]。P-gp介导的多药耐药是肿瘤细胞MDR的主要机制之一[1]。此外,目前临床使用的化疗药物均具有严重的毒副作用,因此导致其临床治疗效果不够理想。而源自蔬菜、水果或海产品的抗肿瘤活性物质一般对人体毒性较低或无毒性,而且其中有些可以有效克服肿瘤多药耐药。因此,该类药物正在成为抗肿瘤药物研发领域的热点[2]。

KA2012MBL复合提取液是以牡蛎肉为主料,配以黄芪、枸杞、植物源维生素C为辅料,应用独特的细胞平衡液制备技术制备而成的。其含有人体所需的多种氨基酸、植物多糖、牛磺酸、维生素、微量元素及其他生物活性物质。前期免疫调节实验发现,KA2012MBL复合提取液对小鼠细胞免疫功能(DTH)和ConA刺激的T淋巴细胞增殖有明显的增强作用;对巨噬细胞功能(碳粒廓清)有促进作用。因此具有显著增强免疫力功效。而该复合提取液对肿瘤细胞的直接杀伤作用及机理尚有待研究。

本文系统评价了KA2012MBL复合提取液在体外对不同肿瘤细胞株的细胞毒活性及对P-gp介导的肿瘤多药耐药的克服能力,并对其抗肿瘤机理进行了初步研究,为该复合提取液的深度开发提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

人白血病细胞株K562/A(耐药株)、K562/S(敏感株)(天津血研所);人胃癌细胞株HGC-27(上海细胞库);KA2012MBL(蓝德奥公司);RPMI-1640(Gibco);胎牛血清(杭州四季青);Trichloroacetic acid(Sigma);Tris-Base(Amresco);乙酸(分析纯)(天津);Apoptosis Kit(Biouniquer);RNase A(Sigma);酶标仪(PerkinElmer/EnSpire2300_001M);96孔板(Costar);6孔板(Costar);Sulforhodamine B(Sigma);FACS(BD FACSCalibur);Rhodamine123(Sigma);离心机(Thermo ST16R);离心机(湘仪H2050R)。

1.2 方 法

1.2.1 细胞培养:培养基为含10%小牛血清PRMI 1640培养液、37℃、5%CO2湿润条件下培养,每隔2~3 d传代1次。

1.2.2 SRB法测定KA2012MBL复合提取液对人白血病细胞株K562/A(耐药株)、K562/S(敏感株)和人胃癌细胞株HGC-27的IC50:向96孔板内加入倍比稀释的 KA2012MBL复合提取液(100 μL/孔),设2个重复孔。然后加100 μL细胞悬液(细胞浓度:6×104cells/mL)到96孔板;空白孔为100 μL 1640和100 μL培养基;同时设立无药物对照孔:100 μL 1640加 100 μL细胞悬液。培养 44 h后,离心 3000 r/min,10 min,去上清,加入冷 16%trichloroacetic acid(100 μL/孔)4 ℃固定0.5 h,自来水冲洗5次,自然凉干。每孔加40 μL 0.4%SRB(1%乙酸溶液)染色45 min。用1%乙酸溶液洗4次,凉干后每孔加 100 μL 10 mmol/L Trisbase(pH10.0)溶解 SRB,震荡10 min,用酶标仪测定吸光度(检测波长为570 nm)。生存率计算方法:生存率(survival rate)=(T-B)/(U-B)×100%,T为药物作用下细胞孔的吸光度,U为无药物对照孔的吸光度,B为空白孔吸光度。将药物浓度和对应浓度下细胞的生存率应用Sigmoid方程进行回归分析,求得药物对细胞的IC50。本研究以阿霉素为P-gp底物药物阳性对照,分别测定阿霉素对K562/A(耐药株)K562/S(取感株)的IC50。

1.2.3 流式细胞术测定凋亡:K562/S细胞(细胞浓度:6×104cells/mL)与终浓度为0.62%(v/v%)的KA2012MBL复合提取液作用48 h(注:该浓度为经预实验优化后所得浓度),同时设立无药对照孔。然后收集细胞,离心2000 g/min,5 min,PBS洗涤2遍后收集细胞,加入500 μL Annexin V Binding Buffer重悬细胞,加入5 μL Annexin V-FITC混匀后,加入5 μL Propidium Iodide混匀,避光,室温反应10 min,应用流式细胞仪检测,激发波长为488 nm,检测波长为530 nm。

1.2.4 流式细胞术测定线粒体膜电位:K562/S细胞(细胞浓度:6×104cells/mL)与终浓度为0.62%(v/v%)的KA2012MBL复合提取液作用48 h(注:该浓度为经预实验优化后所得浓度),同时设立无药对照孔。然后收集细胞,离心2000 g/min,5 min,PBS洗涤2遍后收集细胞,用500 μL PBS溶液重悬细胞后,加入 5 μL 892 μmol/L Rhodamine123(终浓度:8.92 μmol/L)后放入37℃水浴锅中,温浴30 min。离心2000 r/min,5 min,PBS洗2遍后收集细胞,用500 μL PBS溶液重悬细胞,应用流式细胞仪检测,激发波长为488 nm,检测波长为530 nm。

1.2.5 流式细胞术测定细胞周期:K562/S细胞(细胞浓度:6×104cells/mL)与终浓度为0.62%(v/v%)的KA2012MBL复合提取液作用48 h(注:该浓度为经预实验优化后所得浓度),同时设立无药对照孔。然后收集细胞,离心2000 g/min,5 min,PBS洗涤2遍,用10 mL 70%乙醇(-20℃预冷)重悬细胞后置于4℃过夜。离心2000 g/min,5 min,PBS洗涤2遍后收集细胞,用500 μL PBS重悬细胞后加入 5 μL 2 μg/μL RNase A(终浓度:20 μg/mL),放入37℃水浴锅中,温浴30 min,加入5 μL Propidium Iodide混匀后,放入37℃水浴锅中,避光,温浴30 min,应用流式细胞仪检测,激发波长为488 nm,检测波长为530 nm。

2 结果

2.1 KA2012MBL复合提取液对肿瘤细胞的细胞毒活性及对P-gp介导的肿瘤多药耐药的克服能力

按照细胞毒实验标准操作规程,不同浓度KA2012MBL复合提取液分别与K562/S和HGC-27细胞作用44 h,然后应用SRB法检测该复合提取液的细胞毒活性,即 IC50值。结果显示,KA2012MBL复合提取液对K562/S和HGC-27细胞的 IC50值分别为(1.18 ±0.04)%(v/v%)和(1.21±0.17)%(v/v%)。结果说明 KA2012MBL复合提取液具有良好的体外抗肿瘤活性。然后,本研究又测定KA2012MBL复合提取液对K562/A细胞的 IC50值,通过该复合提取液对 K562/A和K562/S的IC50值对该复合提取液对P-gp介导的肿瘤多药耐药的克服能力进行评价。同时测定P-gp底物类化疗药物阿霉素对K562/A和K562/S的IC50值作为P-gp介导的肿瘤细胞多药耐药的阳性对照。结果显示,KA2012MBL复合提取液对K562/A和K562/S的IC50值非常接近,分别为1.12%(v/v%)和1.18%(v/v%)。而P-gp底物类化疗药物阿霉素对K562/A的IC50值远远高于其对K562/S的IC50值,前者的IC50值约为后者的6.12倍。结果说明KA2012MBL复合提取液中抗肿瘤活性成分可有效克服P-gp介导的肿瘤细胞多药耐药。见图1。

图1 应用SRB法测定KA2012MBL复合提取液对K562/A和K562/S的细胞毒活性Fig 1 Cytotoxicity of KA2012MBL against K562/A and K562/S by SRB assay

2.2 KA2012MBL复合提取液对 K562/S细胞线粒体膜电位的影响

向6孔板每孔加入3 mL K562/S细胞(细胞浓度:6×104cells/mL)。在此细胞浓度条件下,K562/S细胞的传代时间为48 h。故将K562/S细胞和0.62%(v/v%)KA2012MBL复合提取液相互作用48 h,同时设立无药物对照孔,然后应用流式细胞仪测定KA2012MBL复合提取液对K562/S线粒体膜电位的影响作用。结果显示,KA2012MBL复合提取液可使K562/S细胞线粒体膜电位显著降低。见图2。

2.3 KA2012MBL复合提取液对K562/S细胞周期的阻滞作用

向6孔板每孔加入3 mL K562/S细胞(细胞浓度:6×104cells/mL)。在此细胞浓度条件下,K562/S细胞的传代时间为48 h。故将K562/S细胞和0.62%(v/v%)KA2012MBL复合提取液相互作用48 h,同时设立无药物对照孔,然后应用流式细胞仪测定KA2012MBL复合提取液对K562/S细胞周期的影响作用。结果显示,相比于无药物对照组,KA2012MBL复合提取液实验组中处于G0/G1期和S期的细胞比率显著增多,而处于G2期细胞的比率则明显减少。说明KA2012MBL复合提取液G2期进行分裂,从而阻止其增殖。见图3。

2.4 KA2012MBL复合提取液对K562/S细胞凋亡的诱导作用

向6孔板每孔加入3 mL K562/S细胞(细胞浓度:6×104cells/mL)。在此细胞浓度条件下,K562/S细胞的传代时间为48 h。故将K562/S细胞和1.6%(v/v%)KA2012MBL复合提取液相互作用48 h,同时设立无药物对照孔,然后用Annexin V-FITC和Propidium Iodide染色后应用流式细胞仪进行细胞凋亡检测。结果显示,KA2012MBL复合提取液作用后,17.2%的K562/S细胞出现凋亡,其中早期凋亡细胞占细胞总数的2.42%,晚期凋亡细胞占细胞总数的14.82%。见图4。

图3 应用流式细胞术分析样品B对K562/S周期的诱导作用Fig 3 Cell cycle arrest activity of KA2012MBL on K562/S cells by FACS analysis

图4 应用流式细胞术检测KA2012MBL复合提取液对K562/S凋亡的诱导作用Fig 4 Apoptosis induction activity of KA2012MBL on K562/S cells by FACS analysis

3 讨论

开发具有高生物活性、低毒副作用并可有效克服肿瘤多药耐药的抗肿瘤药物是目前抗肿瘤药物研发领域的热点[2]。本文研究发现,KA2012MBL复合提取液对不同组织来源的肿瘤细胞株K562/S和HGC-27均具有细胞毒活性。同时本研究结果表明,KA2012MBL复合提取液不是通过物理损伤导致细胞死亡,而是通过与细胞内特异性受体结合后,诱导肿瘤细胞发生凋亡,从而杀死肿瘤细胞。本文研究发现,KA2012MBL复合提取液与K562/S细胞作用48 h后,可导致K562/S细胞线粒体膜电位显著降低。线粒体膜电位降低后,随之呼吸链脱耦联造成线粒体损伤,产生的活性氧类和多种促凋亡因子如凋亡诱导因子(AIF)、细胞素C等释放到胞质[3]。这些因子将激活相关凋亡通路,从而引发内源性细胞凋亡[4-5]。据报道,在体外可以引发肿瘤细胞凋亡的抗肿瘤活性物质,其在体内杀死肿瘤细胞的活性均比较理想,从而成为抗肿瘤新药的可能性要远远高于其他在体外具有抗肿瘤活性的物质[6]。此外,细胞凋亡与细胞周期变化密切相关[7-10]。细胞增殖经过G0/G1-S-G2-M四个时期,本文研究发现,K562/S细胞与KA2012MBL复合提取液作用后,G2/M期细胞比例显著减少,并伴随处于G0/G1前的亚二倍体(DNA 碎片[10-11])增多,说明 K562/S细胞被阻滞在G0/G1期而无法进入G2/M期,从而导致S期和G0/G1期细胞比例相对增加。因细胞周期被阻滞,所以细胞周期相对延长,由此将导致细胞走向凋亡[11-12]。

K562/A细胞株源自K562/S,两株细胞的主要区别在于K562/A为P-gp高表达,而K562/S为P-gp低表达株[13]。如果一种抗肿瘤药物对K562/A的IC50值显著高于其对于K562/S的IC50值,则说明该抗肿瘤药物是P-gp的底物,无法克服P-gp介导的MDR,无开发前景。KA2012MBL复合提取液对K562/A和K562/S的 IC50无明显差异,提示KA2012MBL复合提取液中的抗肿瘤活性成分不是P -gp 的底物[1,10-11],即 KA2012MBL 复合提取液可有效克服P-gp介导的肿瘤多药耐药,具有良好的开发前景。

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Antitumor activity and mechanism of KA2012MBL in vitro

YI Cui-lin1,SHI Jing-jie2,BAO Xue3,WANG Yu-lin3
(1.Dalian Higher Bio Tec Co.Ltd,Dalian116023,China;2.Dalian Landauer Co.Ltd,Dalian116023,China;3.Department of Parasitology,Dalian Medical University,Dalian116044,China)

[Abstract]ObjectiveTo evaluate the antitumor activity of KA2012MBL and the ability to overcome P-gp mediated MDRin vitro.MethodsThe cytotoxicity of KA2012MBL against K562/A,K562/S and HGC-27 were determined by SRB assay.FACS analysis was used to detect the cell cycle arrest activity and apoptosis induction activity of KA2012MBL on K562/S cells and the loss of mitochondria membrane potential(MMP)of K562/S cells caused by KA2012MBL.ResultsKA2012MBL showed excellentin vitrocytotoxicity against K562/A,K562/S and HGC -27,with IC50of(1.12 ±0.15)%(v/v%),(1.18 ±0.04)%(v/v%)and(1.21 ±0.17)%(v/v%),respectively.It also shows ability to overcome P - gp mediated MDR.Furthermore,KA2012MBL caused the loss of MMP of K562/S cells and cell cycle arrest at G0/G1phase,and induced the apoptosis of K562/S cells.ConclusionKA2012MBL exerts its antitumor activity by apoptosis induction in tumor cells,which indicates KA2012MBL would show very potent in vivo antitumor activity.Furthermore,KA2012MBL could overcome P-gp mediated MDR successfully.

[Key words]SRB;cytotoxicity;cell life-cycle;mitochondria membrane potential;apoptosis

R979.1+9

A

1671-7295(2014)01-0018-05

易翠林,时京杰,包雪,等.KA2012MBL复合提取液体外抗肿瘤活性评价及相关机制研究[J].大连医科大学学报,2014,36(1):18 -22.

10.11724/jdmu.2014.01.05

易翠林(1964-),女,德国莱茵兰-法尔茨州兰道市人,博士。E-mail:cuilinyi2008@163.com

王玉林,副教授。E-mail:wangyulin1971@126.com

2013-11-11;

2013-12-05)

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