尿素包合法纯化α-亚麻酸方法的研究

宫宇嘉，王 鑫，徐丽萍

(哈尔滨商业大学 食品工程学院省高校食品科学与工程重点实验室，哈尔滨 150076)

α-亚麻酸(α-LNA)为全顺式9，12，15-十八碳三烯酸.其作为ω-3系列多不饱和脂肪酸具有显著的药理作用和营养价值，在医学界和营养学界备受关注[1-2].但人体内不能产生α-亚麻酸，只能从外源食物中摄取，在体内通过去饱和酶和碳链延长酶的催化作用，合成多烯不饱和脂肪酸EPA和DHA.EPA是体内三烯前列腺素如PGI3、TXA3和五系白三烯的前体；DHA是大脑、视网膜等神经系统膜磷脂的组成成分.这两种物质在降血脂、降血压、抗血栓、抗癌、抗过敏等方面都可发挥重要作用.随着保健食品的兴起，α-亚麻酸已成为重要的保健食品基料[3-5].

1 材料与方法

1.1 实验材料

亚麻籽油，市售.

1.2 主要试剂与仪器

无水乙醇(天津市天博迪化工有限公司)；氢氧化钠(黑龙江阿城化学试剂厂)；盐酸(哈尔滨新达化工厂)；无水乙醚(天津市富宇精细化工有限公司)；无水硫酸钠(天津塘沽邓中化工厂)；甲醇(哈尔滨新春化工厂)；尿素(北京康普汇维科技有限公司)；DK-98-1型电子恒温水浴箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；ALC-1100.2型电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；便携式pHS-3C型数字精密pH计(中国上海仪器厂)；TU-1900 型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；R-205 型旋转蒸发仪(上海申胜生物技术有限公司)；MC 型精密电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；DHG-9203A 型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)

1.3 实验方法

1.3.1 混合脂肪酸的制备

在20 g的亚麻油中加入5% NaOH-乙醇溶液，混匀后置60～65 ℃水浴锅中皂化回流1 h后，在皂化液中加入适量热水溶解，用少量无水乙醚萃取2次，去除高级脂肪醇、碳氢化合物等不皂化物，下层溶液用10 %盐酸调pH值至2～3，置分液漏斗静置分层，取油层用蒸馏水洗至中性，放入60～65 ℃鼓风干燥箱中干燥1 h，即得到亚麻油的混合脂肪酸[6].计算混合脂肪酸得率，计算公式(1)如下：

(1)

1.3.2α-亚麻酸定量分析实验

标准曲线的绘制：将α-亚麻酸转移至25 mL容量瓶中定容，分别移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL至25 mL容量瓶中定容，分别在最大吸收波长处测吸光值，绘制α-亚麻酸标准曲线，根据标准曲线计算出线性回归方程.

1.3.3 尿素包合法提取α-亚麻酸单因素实验

1) 包合时间对产物的影响

称取3 g混合脂肪酸，将m混合脂肪酸∶m尿素∶V甲醇按1∶ 3∶ 8的比例加入，搅拌加热溶解，分别于0 ℃下包合6、9、12、15、18 h，研究包合时间对产物中α-亚麻酸质量浓度的影响.

2) 包合温度对产物的影响

称取3 g混合脂肪酸，将m∶m尿素∶V甲醇按1∶ 3∶ 8的比例加入，搅拌加热溶解，分别于-20、-10、0、10、20 ℃下包合12 h，研究包合温度对产物中α-亚麻酸质量浓度的影响.

3)尿素与脂肪酸质量比对产物的影响

称取3 g混合脂肪酸，加入8倍体积的甲醇作为溶剂，按尿素与脂肪酸质量比分别为1∶ 1、2∶ 1、3∶ 1、4∶ 1、5∶ 1的比例加入尿素，加热溶解后，于0 ℃包合12 h，研究尿素与脂肪酸质量比对产物中α-亚麻酸质量浓度的影响.

4)甲醇体积与质量比对产物的影响

称取3 g混合脂肪酸和3倍质量的尿素于甲醇中，甲醇体积分别按V甲醇∶m尿素为4∶ 3、2∶ 1、8∶ 3、10∶ 3、4∶ 1加入，加热溶解后于0 ℃包合12 h，研究甲醇体积与尿素质量比对产物中α-亚麻酸质量浓度的影响.

1.3.4 响应曲面法优化α-亚麻酸提取工艺条件

采用Box-Behnken模型，以包合时间、尿素与脂肪酸质量比、甲醇体积与尿素质量比三个单因素为影响α-亚麻酸含量的主要考察因子(自变量)，分别以x1、x2、x3表示，并以-1、0、+1分别代表自变量的低、中、高水平，按方程xi=(Xi-x0)/x对自变量进行编码.其中xi为自变量的编码值，Xi为自变量的真实值，x0为试验中心点处自变量的真实值，x为自变量的变化步长，因子编码及水平见表1.并采用多元回归分析，拟合二次多项式回归模型的Box- Behnken设计试验[7-8]，进行结果分析，得到尿素包合法分离亚麻油中α-亚麻酸的优化工艺条件.

1.3.5α-亚麻酸定性分析实验

将尿素包合法提取物质在波长为190～600 nm范围内扫描，比较提取物与标准品图谱的出峰位置及峰形.

表1Box-Behnken实验设计因素水平及编码

因素 代码编码水平编码未编码下水平零水平上水平包合时间/hx1X1111213尿素与脂肪酸质量比x2X2234甲醇体积与尿素质量比x3X322.53

注：编码值与真实值之间的关系为：x1=(X1-12)/1，x2=(X2-3)/1，x3=(X3-2.5)/0.5.

2 结果与讨论

2.1 混合脂肪酸的制备结果与分析

由表2，皂化酸解得到混合脂肪酸产量达平均值为14.61 g，通过混合脂肪酸得率公式可计算出混合脂肪酸的得率为73.07 %.

表2混合脂肪酸的制备

组别产量/g得率/%114.2473.05215.0975.45315.5077.50均值14.6173.05

2.2 α-亚麻酸定量分析试验结果与分析

标准曲线的绘制结果：在300 nm下测定不同质量浓度α-亚麻酸标样的吸光值，拟合得回归方程：y=0.004 7x+0.080 4(R2=0.997 3)，有效线性范围：50～350 μg/mL，绘制标准曲线见图1.

2.3 尿素包合法提取α-亚麻酸单因素实验结果与分析

2.3.1 包合时间对产物的影响结果与分析

图1 α-亚麻酸标准曲线

图2 包合时间对α-亚麻酸质量浓度的影响

由图2可知，在相同条件下，随着包合时间的增加，有利于饱和脂肪酸与尿素形成包合物析出，α-亚麻酸质量浓度随着增大.当包合时间达到12 h后，尿素晶体不再析出，α-亚麻酸质量浓度随时间的增加而减小.所以，包合时间控制在12 h为宜.

2.3.2 包合温度对产物的影响结果与分析

由图3可见，在相同条件下，随着包合温度的增加，α-亚麻酸质量浓度先增加后降低，当包合温度达到0 ℃的时候达到最大值，因为包合温度过高或过低，形成的晶体大且粗糙，使饱和脂肪酸被包合得不牢固，易脱离晶体，因此，包合温度应控制在0 ℃左右[9].

图3 包合时间对α-亚麻酸质量浓度的影响

2.3.3 尿素与脂肪酸质量比对产物的影响结果与分析

由图4可知，当尿素用量较小时，α-亚麻酸质量浓度不高.随着尿素比例增大，α-亚麻酸质量浓度逐渐升高，当尿素与脂肪酸质量比为3∶ 1时，产物中α-亚麻酸质量浓度较高，之后再增加尿素用量，则尿素完全溶解困难、溶解时间加长且α-亚麻酸质量浓度降低，因此，尿素与脂肪酸质量比为3∶ 1为宜.

图4 尿素与脂肪酸质量比对α-亚麻酸质量浓度的影响

2.3.4 甲醇体积与尿素质量比对产物的影响结果与分析

由图5可知，随着甲醇与尿素比值的增大，溶液的饱和度增大，直链脂肪酸与尿素形成六面体晶体析出，饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸还未与尿素形成晶体包合物，尿素晶体已经析出，因此α-亚麻酸质量浓度降低.因此，甲醇体积与尿素质量控制在8∶ 3为宜.

图5 甲醇体积与尿素质比对α-亚麻酸质量浓度的影响

2.4 响应曲面法优化α-亚麻酸提取工艺条件结果与分析

2.4.1 回归模型的建立

由于实际试验过程中，各因素的作用是交互影响的，为了全面考察各个因素的影响，在单因素实验的基础上，设计了包合时间、尿素与脂肪酸质量比、甲醇体积与尿素质量比的三因素三水平响应面法实验设计，其实验结果见表3.

利用Design Expert 软件对表3实验数据进行了多元回归拟合分析，得到α-亚麻酸的质量浓度的多元二次回归方程模型为：Y=178.20-2.25x1+1.00x2+4.75x3-2.00x1x2+2.00x1x3-0.50x2x3-8.85x12-8.85x22-7.85x32

其中：Y为α-亚麻酸质量浓度，μg/mL；x1为包合时间，h；x2为尿素与脂肪酸质量比；x3为甲醇体积与尿素质量比，mL/g.

表3实验设计结果

序号包合时间/h尿素与脂肪酸比甲醇与尿素比/( mL·g-1)α-亚麻酸/(μg·mL-1) 1-1(11.00)1(4.00)0(2.50)163.2121(13.00)10157.4630 (12.00)11(3.00)168.34400(3.00)0179.415000177.896-10-1(2.00)162.227101165.01801-1160.07910-1151.3410-1-1(2.00)0160.48110-1-1154.1112000178.7813-111168.34140-11164.4115000179.09161-10162.0117000178.92

2.4.2 模型及回归方程系数的显著性检验

表4响应面模型方差分析表

变异源平方和自由度均方和F值P值模型1 288.679 143.1929.65<0.000 1失拟项31.003 10.3314.760.0125纯误差2.804 0.70 总和1 322.4716 R=0.9871,R2=0.9744,R2Adj=0.9416

表5回归方程系数显著性检验

因子回归系数自由度标准误差F值P值模型 178.2010.9833.64<0.0001A-2.2510.788.390.0231B0.8210.781.660.2390C1.0010.7837.380.0005AB-2.0011.103.310.1115AC2.0011.103.310.1115BC-0.5011.100.210.6628A2-8.8511.0768.30<0.0001B2-8.8511.0768.30<0.0001C2-7.8511.0753.730.0002

2.4.3α-亚麻酸质量浓度的响应面分析

1)包合时间和尿素与脂肪酸质量比对α-亚麻酸质量浓度的影响

根据响应面法实验的结果，应用Design expert软件得到包合时间和尿素与脂肪酸质量比之间的相互作用对α-亚麻酸质量浓度的影响，如图6所示.

图6 包合时间、尿素与脂肪酸质量对α-亚麻酸的等高线图和响应曲面

从图6中包合时间和尿素与脂肪酸质量对α-亚麻酸的响应面和等高线图可以得出：当包合时间处在最佳值时，随着尿素与脂肪酸质量比的增加，α-亚麻酸质量浓度先增大后减小.最佳水平的包合时间为12.80 h，尿素与脂肪酸质量比为2.82.

2)包合时间和甲醇体积与尿素质量比对α-亚麻酸质量浓度的影响

根据响应面法实验的结果，应用Design expert软件得到包合时间和甲醇体积与尿素质量比之间的相互作用对α-亚麻酸质量浓度的影响，如图7所示.

图7 包合时间、甲醇体积与尿素质量对α-亚麻酸的等高线图和响应曲面

从图7中包合时间和甲醇体积与尿素质量比对α-亚麻酸的响应面和等高线图可以得出：当包合时间处在最佳值时，随着甲醇体积与尿素质量比的增加，α-亚麻酸质量浓度先增大后减小.最佳水平的包合时间为12.80 h，甲醇体积与尿素质量比为2.44.

3)尿素与脂肪酸质量比和甲醇体积与尿素质量比对α-亚麻酸质量浓度影响

根据响应面法实验的结果，应用Design expert软件得到尿素与脂肪酸质量比和甲醇体积与尿素质量比之间的相互作用对α-亚麻酸质量浓度的影响，如图8所示.

图8 尿素与脂肪酸质量比、甲醇体积与尿素质量比对α-亚麻酸的等高线图和响应曲面

从图8中尿素与脂肪酸质量比和甲醇体积与尿素质量比对α-亚麻酸的响应面和等高线图可以得出：当尿素与脂肪酸质量比处在最佳值时，随着甲醇体积与尿素质量比的增加，α-亚麻酸质量浓度先增大后减小.最佳水平的尿素质量与脂肪酸质量比为2.82，甲醇体积与尿素质量比为2.44.

2.5 α-亚麻酸定性分析试验结果与分析

将尿素包合法提取出的样品采用双光束紫外分光光度法检测，以无水乙醚为空白，在波长为200～600 nm范围内进行扫描，如图9得到其最大吸收波长为300 nm，与α-亚麻酸标准品溶液所测出的最大吸收波长相吻合，即样品中含有α-亚麻酸.

图9 α-亚麻酸样品及标品对照紫外光谱图

3 结 语

以亚麻籽油为原料，采用尿素包合法分离、提取α-亚麻酸，通过双光束紫外分光光度计扫描确定α-亚麻酸的最大吸收波长，分别考察包合时间、包合温度、尿素与脂肪酸质量比、甲醇体积与尿素质量比对提取α-亚麻酸的影响，通过响应曲面优化提取α-亚麻酸的最佳工艺条件即包合时间为12.80 h，尿素与脂肪酸质量比为2.82，甲醇体积与尿素质量比为2.44的数据结果显著，其条件下α-亚麻酸的质量浓度为175.96 μg/mL.采用紫外光谱检测将样品与标准品进行对照，确定提取物富含α-亚麻酸.

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