设施土壤茄子黄萎病菌的分离及其分布规律研究

雷玉明 （河西学院农业与生物技术学院，甘肃 张掖 734000；甘肃省高校河西走廊特色资源省级重点实验室，甘肃 张掖 734000；河西绿洲农业研究院，甘肃 张掖 734000）

张建朝 （甘肃省张掖市植保植检站，甘肃 张掖 734000）

邢会琴 （河西学院农业与生物技术学院，甘肃 张掖 734000）

费永祥 （甘肃省张掖市植保植检站，甘肃 张掖 734000）

孟嫣 （河西学院农业与生物技术学院，甘肃 张掖 734000）

茄子黄萎病是由病菌Verticillium dahliae Kleb.引起，俗称 “半边疯”、“黑心病”［1］。它发病快、传播面广，危害严重。特别是陆地栽培茄子，一般病田发病率为30%～40%，减产20%～30%，重病田发病率达70%以上［2］。随着设施茄子栽培面积的不断扩大，茄子黄萎病对设施茄子的危害越来越重。关于土壤黄萎病菌土壤分离培养已有较多研究，但Harris等［3－5］报道采用土壤浸提液或植株浸提液分离棉花黄萎病菌和吕金殿等［6－7］建立的棉选1号选择性培养基都存在成分复杂、杂菌污染严重等问题，后来杨家荣等［8］结合上述培养基的优点，建立了棉花黄萎病菌土壤分离的选择性培养基。但这些研究大都应用于棉田，而在设施茄子栽培田中分离与分布规律至今报道较少。为此，本研究探讨了设施栽培田中茄子黄萎病菌分离方法与分布规律，以为设施土壤微生物多样性研究和防治茄子黄萎病提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 土壤浸提液与培养基的制备

土壤浸提液的制备：将茄田的肥沃土1kg置于2L容器的三角瓶中，加蒸馏水1000ml，在沸水中浸提1h，再经多次过滤澄清后定容为1000ml，置4℃下保存备用。

培养基选择棉花黄萎病菌选择性培养基［8］。但在培养基制作中加入设施茄田土壤浸提液25ml／1000ml，PCNB（五氯硝基苯）100μg／ml，经121℃高压灭菌30min。待培养基温度降至45℃时，每1000ml培养基加抗菌素液50ml（含氯霉素0.05g、链霉素0.05g、160万单位青霉素－G盐0.05g），充分混匀后每皿倒培养基15ml。

1.2 病菌的分离方法

（1）土壤稀释法分离 分别称取土样5、10、20g于含200ml无菌水的三角瓶中，静置20min后，充分摇动5min，静置，弃上清液留土壤残留物20ml于瓶底，然后再加入无菌水定容为200ml，充分摇动后静置5min弃上清液。这样连续5次悬浮液稀释土样，稀释系数1／400。最后一次悬浮液经弃上清液后留土壤残留40ml于瓶底，然后用灭菌移液管均匀吸取土样液2ml于培养基表面均匀展布，设重复5皿，相对接种量分别为0.25、0.50、1.00g。接种土样液的培养皿置超净工作台上使培养基表面余水自然风干，在25℃下培养培养4周。镜检前，用自来水将待检培养皿浸泡30min，用手指在自来水细水冲冼下轻轻摸掉生长在培养基表面的土粒，并借助于人工光源在双目解剖镜下计数培养基表面的茄子黄萎病菌的生长菌落数 （colony forming unit，cfu）［8－9］。

（2）土壤水筛法分离 分别称取土样5、10、20g于含200ml自来水的三角瓶中，静置20min后，充分摇动5～10min，并在自来水下用200～38μm筛网过筛土样液。土样液经自来水缓慢冲冼后，留在下层38μm筛网上的土壤残留物全部移到三角瓶中，用蒸馏水定容为40ml。用开口移液管均匀吸取土样液2ml于培养基表面均匀展布，设重复5皿，相对接种量分别为1.25、0.50、1.00g。接种土样液的培养皿置超净工作台上使培养基表面余水自然风干，显微镜检计数，方法与土壤稀释法分离相同。

1.3 病菌分离规律试验

（1）水平分布土样采集与制备 试验土样从供试温室中用原土取土器棋盘式取样［10］，每座温室任选取30m2的点6个，分别在每个点随机5点取样，取土深度15cm，然后将5点土样混匀后在室内自然风干1周过筛 （筛孔直径2mm），过筛土样含水量控制在5%以下，然后装入塑料袋中置4～5℃恒温条件下保存备用。

（2）垂直分布土样采集与制备 在供试茄子黄萎病发生严重的温室，用取土器分别取10、20、30、40cm不同深度的土样，按水平分布土样的方法处理。

（3）测定指标 用分布型指数法测定微菌核分布规律，选取6项指标，分别是X＊平均拥挤度、X平均值、K矩法测定值、S样本总方差、L指标、X＊／X聚集指标。K值的大小说明聚集度的大小，K值愈大，聚集度愈小。K值趋于无穷大时，X／K趋于0。X＊＝X，即泊松分布，生物样本为随机分布。K值愈小，则聚集度愈大。根据聚集指数分布，X＊／X＞1时为聚集分布，L／1＋X ＞1时为聚集分布。

2 结果与分析

2.1 茄子黄萎病菌土壤稀释法与水筛法的比较

从表1可以看出，土壤稀释法与水筛法随每皿接种量的增加，培养基检测出的茄子黄萎病菌菌落数呈递减趋势，且菌核检测数也呈下降趋势，并出现其他真菌的生长。其中土样接种量为0.25g时的检测效果明显高于0.50g和1.00g，当接种量0.25g时，采用水筛法分离，总菌落数为223个，平均每皿检测出茄子黄萎病菌菌落44.2个，其中有2个菌落不产生菌核，产生微菌核221个，与稀释法分离相比，分别高出93.27%、95.92%，检测率达99.1%，无细菌污染，真菌污染率达0.89%。当接种量0.50g时，采用水筛法分离，总菌落数为190个，平均每皿检测出茄子黄萎病菌菌落30.6个，其中有37个菌落不产生菌核，产生微菌核153个，与稀释法分离相比，分别高出93.68%、96.08%，检测率达80.5%，真菌污染率达19.5%。当接种量1.00g时，采用水筛法分离，总菌落数为122个，平均每皿检测出茄子黄萎病菌菌落13个，其中有55个菌落不产生菌核，2个细菌菌落，产生微菌核65个，与稀释法分离相比，分别高出81.15%、92.30%，检测率达53.28%，细菌污染率达1.64%，真菌污染率达45.08%。经显著性比较，土壤分离法的显著性较差，接种1.00g时，已无检测能力。

表1 2种分离法对茄黄萎病菌检测效果的比较

2.2 茄子黄萎病菌在温室土壤中的水平分布

从表2可以看出，微菌核在各温室中的分布很不均匀。1～4号温室微菌核数在8.37～36.80个／g干土之间，1和3号温室中的微菌核数最少，分别在8.37、9.01个／g干土，4号温室微菌核数居中，2号温室的微菌核最多达36.80个／g干土。

对数据进行频度分析，根据聚集指数和L指数分析看，1～4号温室中，微菌核在各温室中的数量分布各不相同，且各温室之间的微菌核数的变异程度较大。其X＊／X、L／1＋X值均大于1。因此，微菌核在温室中有分布呈聚集分布，这种聚集与田间病害的发生形成发病中心是互相一致的。

表2 温室土壤中茄子黄萎病菌分布型指数

2.3 茄子黄萎病菌在温室土壤中的垂直分布

在供试温室中分别取10、20、30、40cm不同深度的土壤，检测土壤中的微菌核的分布数量。表3结果表明：每克干土中0cm处平均微菌核数为6.25个，每克干土中10cm处平均微菌核数为85个，20cm处微菌核数为163个，30cm处微菌核数为63个，40cm处微菌核数为8.5个。由此可以看出，20cm处微菌核数量最多，40cm处微菌核数分布最少，表明微菌核主要分布于耕作层中，而且随着土壤深度的增加，微菌核数明显减少。

表3 不同土壤层茄子黄萎病菌微菌核分布 个

3 讨论与小结

（1）经分离检测，棉花黄萎病菌选择性培养基对茄子黄萎病菌有较强的检测能力。采用土壤稀释法和水筛法进行微菌核分离的比较试验表明：随培养基接种量的增加，分离出的茄子黄萎病菌菌落数随之下降，且污染率随着上升。水筛法较稀释法可大幅度提高土壤茄子黄病菌的分离能力，增加幅度4.6%～9.6%，接种量0.25、0.5、1.00g／皿。证实了棉花黄萎病菌检测分离技术可成功应用于茄子黄萎病菌的分离，为茄子黄萎病菌基础性研究奠定了基础。

（2）对保护地茄子黄萎病微菌核的检测和统计结果表明：茄子黄萎病菌在保护地的分布规律与大田规律相似，水平分布呈聚集分布，垂直分布依土层深度的增加，微菌核数减少。病菌主要分布于10～20cm耕作层的范围内，0、40cm处病菌数量较少。病害在温室空间分布与病菌空间分布有一定的相关性，即病害在温室的发生也是不均匀的。温室内茄子黄萎病菌的分布规律在国内属首次报道。这对研究温室茄子黄萎病菌的流行学和生态学研究具有十分重要的指导意义，对保护地土壤采用日光辐射处理具有现实指导意义。

［1］张国相.茄子黄萎病发病逐年加重的原因及防治措施 ［J］.农业科技通讯，1996，（6）：31.

［2］董金皋.农业植物病理学 （北方本）［M］.北京：中国农业出版社，2001：395－397.

［3］Harris D C，Yang J R，Ridout M S.The detection and estimation of Verticillium dahliae in naturally infested soil［J］.Plant pathology，1993，42：238－250.

［4］Isaac I，Fletcher P，Harrison J A C.Quantitative isolation of Verticilliumspp.from soil and moribund potato haulm ［J］.Annals ofApplied Biology，1971，67：177－183.

［5］Huisman O.C.Seasonal colonization of roots of fied－grown cotton by Verticillium dahliae and V.tricorpus ［J］.Phytopathology，1988，78：708－716.

［6］吕金殿，杨家荣，吉冉中.土壤棉花黄萎病菌分离方法研究 ［J］.植物病理学报，1989，19（1）：52.

［7］籍秀琴，朱颖初.土壤棉黄萎病菌选择性培养基——棉选一号 ［J］.植物病理学报，1988，18（3）：187－190.

［8］杨家荣，商鸿生.分离土壤棉花黄萎病菌选择性培养基的筛选 ［J］.植物病理学报，2002，32（3）：236－240.

［9］李雪玲，张天宇，王立新.棉黄萎病菌微菌核研究进展 ［J］.植物保护，1997，23（5）：35－37.

［10］郭岩，杨之为.大丽轮枝菌在茄田土壤中的分布及抽样方法 ［J］.植物保护，1999，25（6）：1－4.