不同年龄组抑郁症模型大鼠Meynert基底核神经元凋亡

宫国良 张元鑫 周昭杰 张晓杰

(汕头潮南民生医院病理科，广东 汕头 515144)

世界卫生组织报道，全球现有抑郁症患者3.4亿，在10大疾病排位中已上升为第5位〔1〕。研究认为抑郁症是一种多基因疾病，是在遗传因素基础上，在环境因素的应激作用下，使基因易损个体脑内特定部位，主要是边缘系统神经细胞凋亡与再生共扼平衡失调，引起的以情绪改变为主，并伴有免疫内分泌功能改变和其他神经功能异常的精神疾病〔2〕。Meynert基底核是边缘系统的重要组成部分，是新皮层胆碱能神经支配的主要来源，并被认为是情绪-动机中枢与大脑皮层之间的胆碱能转换站。研究显示〔3〕，Meynert基底核胆碱能神经元及其递质乙酰胆碱与抑郁症的发病有关。本实验选取胆碱能神经元中枢-Meynert基底核进行抑郁症发病过程中神经元的凋亡情况的研究，并探讨凋亡与年龄的关系。

1 材料与方法

1.1材料 清洁级Sprague-Dawley大鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司〔许可证编号SCXK(京)2007-0001〕。Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(美国BIPE公司)，FACS Calibur流式细胞仪(美国BD公司)，EM-208S型透射电镜(荷兰飞利浦公司)。

1.2动物模型制备 通过敞箱实验每组选择评分相近的32只，分别进入同年龄组的模型组与对照组。单笼饲养，对照组正常饲养，不加任何刺激。模型组应用慢性轻度不可预见性应激制作动物模型〔4〕，包括：禁食24 h，禁水24 h，夹尾1 min，4℃冰水游泳5 min，电击足底(30 v，10 s/次，间隔10 s，共10次)，束缚应激6 h，鼠笼倾斜24 h，60℃烘烤15 min，振荡30 min。每日给予一种刺激，每种刺激累计使用2～3次，顺序随机，使动物不能预料刺激的发生，共计21 d。

1.3抑郁症模型评价 在实验前1 d及实验第21天，用敞箱实验和糖水偏爱度实验观察各组大鼠行为的变化。实验时将单只大鼠置于100 cm×100 cm×50 cm光洁敞箱中央，敞箱底面分为25个等边方格，记录大鼠5 min内水平运动和垂直运动得分。禁食禁水24 h后，进行糖水偏爱度实验，每笼同时给予 2个水瓶，1瓶装 1％蔗糖水，1瓶装纯水，60 min后称量糖水及纯水消耗量，计算糖水偏爱度。

1.4Meynert基底核神经元细胞凋亡检测 最后一次行为测试结束后，每组随机抽取8只大鼠，速断头取脑，参照大鼠脑立体定位图谱〔5〕，在冰块上切取Meynert基底核。将Meynert基底核组织剪碎，利用流式细胞制备仪研磨成细胞悬液，调细胞浓度约1×106个/ml，参照试剂盒说明，加入10 μl AnnexinV-FITC和5 μl PI，混匀避光孵育15 min，加入400 μl结合缓冲液后上机检测。

1.5透射电镜观察细胞超微结构 行为测试结束后，每组随机抽取5只大鼠，各组大鼠所取脑组织投入到2.5％戊二醛磷酸盐缓冲液中固定24 h，四氧化锇后固定2 h，乙醇、丙酮逐级脱水，环氧树脂812包埋组织块，修块制成1 μm半薄切片，1％ NaOH无水乙醇软化，光镜定位，并精修制备超薄切片，用KCQ-1型超薄切片机切片，醋酸双氧铀和枸橼酸铅双重电子染色，EM-208S型透射电子显微镜观察并拍照。

1.6统计学处理 应用SPSS14.0软件进行单因素方差分析和LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组旷场行为、糖水消耗量比较 经过21 d慢性应激后，模型组水平运动得分、垂直运动得分、糖水消耗量显著低于对照组(P<0.01)，且14～15月龄模型组显著低于4～5周龄和4～5月龄模型组(水平运动得分t值分别为9.400、6.084，垂直运动得分t值分别为7.841、9.036，糖水消耗量t值分别为14.604、18.778，P均<0.01)。见表1。

2.2各组Meynert基底核细胞凋亡率检测结果 4～5周龄、4～5月龄、14～15月龄模型组较对照组细胞凋亡率明显增加〔(16.86±2.41)％ vs (7.26±1.33)％、(17.90±2.29)％ vs (8.02±0.95)％、(27.91±4.64)％ vs (8.87±9.38)％，均P<0.01〕。14～15月龄模型组细胞凋亡率与4～5周龄、4～5月龄模型组组间差异显著(t值分别为7.06、5.975，P均<0.01)，4～5周龄与4～5月龄模型组差异不显著(t=0.885，P>0.05)。

2.3各组Meynert基底核透射电镜观察细胞超微结构结果 对照组随年龄增长细胞器结构逐渐减少，凋亡细胞增加，均呈早期凋亡表现。各模型组均可见细胞胞核固缩，线粒体嵴断裂呈絮状变性，神经元尼氏体崩解脱颗粒，内质网扩张，脂褐素沉积，神经元细胞凋亡、坏死。凋亡神经元细胞核膜下异染色质边集，核固缩，细胞器变性，膜性结构完整。且随年龄增长细胞器变化明显，凋亡逐渐增加，以14～15月龄模型组最重(图1)。

表1 各组敞箱实验水平得分、糖水消耗量比较

4～5周龄对照组(×8 000)

4～5周龄模型组(×6 300)

4～5月龄对照组(×5 000)

4～5月龄模型组(×6 300)

14～15月龄对照组(×6 300)

14～15月龄模型组(×16 000)

3 讨 论

细胞数量的生物稳态是通过细胞增殖和细胞死亡之间的平衡来维持的，其中细胞凋亡又称为程序化细胞死亡，是神经生长发育和衰老及维护其正常结构与功能的重要机制之一〔6～8〕。研究已证实，慢性应激导致抑郁症发病，然而对于其发病机制尚存在不同观点，一般认为，在慢性应激过程中多种神经元保护机制的缺失、神经元细胞凋亡的活跃，是导致大脑器质性损害的主要原因〔9〕，从而引发抑郁发作。研究发现〔3〕，抑郁症模型鼠存在Meynert基底核神经元超微结构的改变及其递质乙酰胆碱的变化。

本实验采用慢性轻度不可预见性应激动物模型，该模型在每个个体的使用过程中都会存在或多或少的改变，但机制是相同的。由于慢性应激采用了多变的令动物不愉快的应激方式，并且每种应激的实施是不可预知完全随机的，类似于人们日常生活中遭遇的各种突发性应激事件，因此较好地模拟了抑郁症发生的环境诱因。

本实验表明伴随机体衰老，大鼠对新环境的好奇心及适应能力逐渐下降，表现出一种淡漠情绪。在刺激强度相同条件下，年龄的增长导致抑郁症模型行为学变化更显著，这与其他文献报道也相符合〔10〕。流式细胞仪检测结果与电镜结果均证实抑郁症模型鼠存在明显细胞凋亡，且随年龄增长凋亡增加。表明：Meynert基底核参与了抑郁症的发病过程，其机制可能由神经元凋亡引起，且随年龄增长凋亡增加。机体对应激的反应性及耐受性和年龄有密切关系，Selye〔11〕在1970年提出了关于衰老的应激学说，认为应激可加速衰老过程，此后应激和衰老之间的关系开始受到重视。老龄大鼠对慢性应激的敏感性增强，应激损伤更加严重，主要表现在对新环境缺乏探索兴趣，兴奋性及适应能力明显降低。衰老动物对慢性应激的敏感性较高，因此，应激损伤更加严重。综上，Meynert基底核神经元凋亡与抑郁症发病相关，且此种形态改变与年龄的变化有密切关系。

4 参考文献

1韦盛中，张 玲，杨 丽.精神疾病负担的研究进展〔J〕.中华行为医学与脑科学杂志，2010；19(5)：478-80.

2Yildiz-Yesiloglu A，Ankerst DP.Review of 1H magnetic resonance spectroscopy findings in major depressive disorder：a metaanalysis〔J〕.Psych Res Neuroimag，2006；147(1)：1-25.

3宫国良，董海影，张英博，等.不同年龄组抑郁症模型鼠Meynert基底核形态学研究〔J〕.齐齐哈尔医学院学报，2010；30(6)：647-48.

4Willner P.Validity，reliability and utility of the chronic mild stress model of depression：a10-year review and evaluation 〔J〕.Psychopharmacology，1997；134(4)：319-29.

5Paxinos G，Watson C.大鼠脑立体定位图谱〔M〕.第3版.北京：人民卫生出版社，2005：21-30.

6温进坤，韩 梅.医学分子生物学理论与研究技术〔M〕.第2版.北京：科学出版社，2002：246-58.

7Oppenheim RW.Naturally occurring cell death during neural development〔J〕.Trends Neurosci，1985；17：487.

8Linda JM，Jean M.Apoptosis〔J〕.Science，1998；281：1301-2.

9何国琪，张建荣，王兴祥，等.神经营养因子3在慢性应激诱发抑郁症的作用机制研究〔J〕.中国全科医学，2006；9(20)：1680-82.

10张晓杰，兴桂华，董海影，等.不同年龄组抑郁症模型大鼠脑乙酰胆碱酯酶及乙酰胆碱转移酶活性的变化〔J〕.中国老年学杂志，2012；32(6)：1193.

11Selye H.Stress and aging〔J〕.J Am Ger SoCi，1970；18：669-80.