结缔组织生长因子在糖尿病大鼠肾脏损伤中的作用及丝胶的干预效果

杨振军 刘东慧 宋成军 陈志宏

(承德医学院人体解剖学教研室，河北 承德 067000)

结缔组织生长因子(CTGF)是与促进纤维化和细胞外基质(ECM)沉积密切相关的细胞因子，可通过促进ECM沉积在肾小管间质纤维化、肾小球硬化等方面发挥重要作用〔1〕。人体的多种组织器官，如心血管系统、脑、肝脏、骨骼肌、消化道、肾脏和胰腺等均发现有CTGF存在，其中肾脏的含量最高，但在生理情况下CTGF的表达水平很低〔2〕。目前，治疗糖尿病多采用控制饮食、运动、口服降糖药物、注射胰岛素等方法，但上述方法均有其治疗的局限性，并且均不能有效改善胰岛素抵抗及保护胰岛细胞〔3,4〕。根据民间蚕茧泡水辅助降糖的用法，本课题组进行了初步探讨，发现丝胶可有效降低血糖、改善糖尿病时血脂代谢紊乱及保护糖尿病时生殖功能障碍〔5,6〕。

1 材料与方法

1.1动物、分组及处理 48只清洁级健康雄性SD大鼠，体重200～250 g，购自河北医科大学实验动物中心，合格证号：712024。随机选取其中的12只作为正常对照组，常规饲养，腹腔注射同等剂量链脲佐菌素(STZ)溶剂3次(1次/d)；其余的36只大鼠按25 mg/kg的剂量连续3 d腹腔注射2％的STZ，成模标准是注射STZ 1 w后空腹血糖(FPG)≥16.7 mmol/L〔7〕。成功建立2型糖尿病模型的大鼠随机分为糖尿病模型组、丝胶治疗组和阳性对照组，每组12只，丝胶治疗组大鼠按照2.4 g·kg-1·d-1的剂量灌胃给予丝胶35 d，阳性对照组大鼠灌胃给予二甲双胍(55.33 mg·kg-1·d-1)35 d，正常对照组、模型组大鼠灌胃给予等容积生理盐水35 d。

1.2药物和试剂 丝胶(承德医学院蚕业研究所)：浸泡后水煎2次，合并滤液并浓缩。STZ美国Sigma公司，用枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液(pH4.4)配制；血糖检测试剂盒，保定长城临床试剂有限公司；纤维连接蛋白酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒，南京建成生物工程研究所；兔抗CTGF多克隆抗体，北京博奥森生物技术有限公司；辣根酶标记的山羊抗兔IgG(二抗)，美国KPL公司；BCA蛋白定量试剂盒、蓝色预染蛋白质Marker、蛋白裂解液、1 200 bp DNA Ladder，北京泰格美科技有限公司；β-actin单克隆抗体，美国Santa公司；Trizol，美国Invitrogen公司；CTGF、β-actin引物，上海生工公司；PCR试剂盒，大连宝生物工程有限公司。

1.3检测血液指标 4％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，经内眦取血，3 000 r/min离心20 min后收集血清，-20℃冰箱保存。葡萄糖氧化酶法检测血糖，ELISA法检测纤维连接蛋白含量。

1.4大鼠肾脏CTGF表达的检测 大鼠取血后断头处死，取肾脏入液氮保存。

1.4.1Western 印迹法检测CTGF蛋白的表达 取液氮保存肾脏提取蛋白，BCA蛋白定量试剂盒定量蛋白浓度。每个上样孔加80 μg总蛋白行12％ SDS-PAGE凝胶电泳，电转移至PVDF膜；5％脱脂奶粉37℃封闭1 h，加一抗(β-actin 1∶1 000、CTGF 1∶100)于4℃过夜；洗膜后加入辣根酶标记的山羊抗兔IgG(1∶5 000)室温摇床孵育1 h，洗膜后加入Super ECL Plus超敏发光液，曝光后扫描。以β-actin为内参照，采用Quantity One-v 4.6.2软件对Western条带进行定量分析，以目的蛋白条带与β-actin条带的灰度比值，作为CTGF蛋白的相对表达水平。

1.4.2RT-PCR法检测CTGF mRNA的表达 取液氮保存肾脏，按Trizol试剂说明提取肾脏总RNA，并反转录成cDNA，产物进行PCR。PCR引物序列：CTGF正义链:5’- CCTACCGACTGGAAGACACATT-3’，反义链:5’-GATGCACTTTTTGCCCTTCTTA-3’，退火温度56℃，循环次数：30次，产物大小230 bp；β-actin正义链:5’-GAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，反义链:5’-CTGGAAGGTGGACAGTGAG’-3，退火温度55℃，循环次数：29次；产物大小445 bp。PCR反应体系50 μl，取5 μl扩增产物及5 μl DNA Ladder行2％琼脂糖凝胶电泳(90 V，40 min)，ZF型紫外透射反射分析仪摄像，应用Quantity One-v 4.6.2软件进行分析，以目的条带和β-actin条带吸光度的比值，作为CTGF mRNA的相对表达水平。

1.5统计学分析 采用SPSS17.0软件，多组间均数的比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。

2 结 果

2.1各组大鼠肾脏CTGF的表达 模型组大鼠肾脏CTGF蛋白及mRNA的表达较正常对照组大鼠高(P<0.01)；丝胶、二甲双胍均可明显降低糖尿病模型大鼠肾脏CTGF的表达，丝胶治疗组、阳性对照组大鼠肾脏CTGF蛋白及mRNA的表达明显较模型组大鼠低(P<0.01，P<0.05)。见图1，图2、表1。

图1 大鼠肾脏CTGF mRNA的表达

2.2各组大鼠的血糖和血清纤维连接蛋白的含量 与正常对照组比较，模型组大鼠的血糖、纤维连接蛋白的含量明显升高(P<0.01)；与模型组比较，丝胶治疗组、阳性对照组大鼠的血糖和纤维连接蛋白的含量明显降低(P<0.01)。见表1。

1.正常对照组，2.模型组，3.丝胶治疗组，4.阳性对照组,下图同

与模型组比较：1) P<0.01,2) P<0.05

3 讨 论

有研究发现，3～5个月的糖尿病大鼠，肾小球和整个肾皮质CTGF mRNA的表达均明显增加〔8〕；本研究也证实了这一点，糖尿病模型大鼠肾脏CTGF蛋白和mRNA的表达水平明显升高。糖尿病时，高血糖、晚期糖基化终末产物、血管紧张素Ⅱ、5-羟色胺等均可导致肾脏CTGF表达水平的升高〔9,10〕。CTGF表达上调后，一方面通过抑制基质金属蛋白酶(MMPs)的活性打破MMPs/TIMPs的平衡，使ECM合成和降解的平衡失调，从而引发肾间质纤维化〔11,12〕；另一方面，CTGF可在许多方面介导TGF-β1的致肾脏纤维化作用〔13〕。CTGF作为介导TGF-β1致纤维化的因子，可通过促进细胞有丝分裂和TGF-β1的作用，使ECM成分合成增加、降解减少，进而导致肾脏肥大、肾小球硬化以及肾小管纤维化〔14〕。研究资料显示，应用转化生长因子(TGF)-β1和CTGF刺激细胞能加速ECM合成，而降低TGF-β1和CTGF的表达，可通过减少ECM合成保护肾脏损伤〔15,16〕。本研究发现，丝胶可明显降低糖尿病模型大鼠血清ECM成分纤维连接蛋白的含量，降低糖尿病模型大鼠肾脏CTGF的表达。本研究表明，丝胶可通过下调CTGF的表达，一方面恢复糖尿病时肾脏MMPs/TIMPs的平衡状态，另一方面拮抗CTGF介导的TGF-β1的致肾脏纤维化的作用；因此，丝胶可通过减少ECM的合成恢复ECM合成和降解的平衡，延缓肾小球硬化和肾间质纤维化的发生发展，发挥对糖尿病肾脏损伤的保护作用。本研究为进一步开发利用蚕茧治疗糖尿病及其并发症提供了可靠的实验资料。由于丝胶是天然的蛋白质，可避免化学合成药物带来的毒副作用，值得进一步探讨丝胶治疗糖尿病及其并发症的相关作用及机制。

4 参考文献

1Ito Y,Aten J,Nguyen TQ,etal.Involvement of connective tissue growth factor in human and experimental hypertensive nephrosclerosis〔J〕.Nephron Exp Nephrol,2011;117(1):e9-20.

2Wada J,Makino H,Kanwar YS.Gene expression and identification of gene therapy targets in diabetic nephropathy 〔J〕.Kidney Int,2002;61(1): S73-8.

3Kang JH,Chae YM,Park KK,etal.Suppression of mesangial cell proliferation and extracellular matrix production in streptozotocin-induced diabetic rats by Sp1 decoy oligodeoxynucleotide in vitro and in vivo〔J〕.J Cell Biochem,2008;103(2):663-74.

4McAlister FA,Eurich DT,Majumdar SR,etal.The risk of heart failure in patients with type 2 diabetes treated with oral agent monotherapy 〔J〕.Eur J Heart Fail,2008;10(7):703-8.

5付秀美，钟美蓉，付文亮，等.丝胶对2型糖尿病大鼠是血糖和血脂的影响〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(1)：103-5.

6赵连志，杨松鹤，李山山，等.丝胶预处理对糖尿病大鼠睾丸生长激素和生长激素受体表达的作用〔J〕.中国老年学杂志，2012;32(9)：1850-2.

7Liu Y,Qi H,Wang Y,etal.Allicin protects against myocardial apoptosis and fibrosis in streptozotocin-induced diabetic rats 〔J〕.Phytomedicine,2012;19(8-9):693-8.

8唐 庆，王小琴，马 俊，等.肾安提取液对糖尿病肾病小鼠肾脏结缔组织生长因子及Ⅳ型胶原的影响〔J〕.成都中医药大学学报，2010;33(2)：71-3.

9Du J,Wang L,Liu L,etal.IFN-γ suppresses the high glucose-induced increase in TGF-β1 and CTGF synthesis in mesangial cells 〔J〕.Pharmacol Rep,2011;63(5):1137-44.

10栾 健，王 艳，马瑞霞，等.复方肾炎片对STZ诱导糖尿病大鼠作用研究〔J〕.中国中西医结合肾病杂志，2010;11(11)：1000-2.

11刘 圣，胡世莲，叶山东，等.结缔组织生长因子与糖尿病肾病及中药干预〔J〕.中国临床保健杂志，2010;13(1)：101-4.

12Wang X,Zhou Y,Tan R,etal.Mice lacking the matrix metalloproteinase- 9 gene reduce renal interstitial fibrosis in obstructive nephropathy 〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol,2010;299(5): F973-82.

13Hao HH,Shao ZM,Tang DQ,etal.Preventive effects of rutin on the development of experimental diabetic nephropathy in rats 〔J〕.Life Sci,2012;91(19-20):959-67.

14杨 敏，黄海长，李惊子，等.结缔组织生长因子协同转化生长因子β1的促肾纤维化效应〔J〕.中华医学杂志，2004;84(7)：569-72.

15Fujita H,Fujishima H,Takahashi K,etal.SOD1,but not SOD3,deficiency accelerates diabetic renal injury in C57BL/6-Ins2(Akita) diabetic mice 〔J〕.Metabolism,2012;61(12):1714-24.

16马瑞霞，徐 岩，张 娟，等.雷云藤甲素联合厄贝沙坦对2型糖尿病大鼠细胞损伤的协同保护作用[J].中华内科杂志，2012;51(2):117-22.