高糖培养的视网膜Muller细胞中embelin对VEGF蛋白质表达的抑制作用

孙雅彬 宋 鄂 郝继龙 叶 飞 张 泳 徐越超

(吉林大学第一医院眼科，吉林 长春 130021)

眼内新生血管生成是糖尿病性视网膜病变(DR)病情发展的重要标志〔1〕。血管内皮生长(VEGF)及其受体在血管新生、血管分化及增加血管通透性等方面起重要作用〔2，3〕。然而，在 DR眼内新生血管生成中，调控VEGF蛋白质表达的确切机制尚不清楚。在高糖情况下，Müller细胞在病理性眼内新生血管生成中起到至关重要的作用〔4〕。应用XIAP抑制剂embelin研究高糖情况下XIAP对VEGF表达的调控作用。

1 材料与方法

1.1化学药品 Embelin (Sigma公司，美国)，贮存原液浓度为50 mmol/L，溶解于DMSO (Sigma公司，美国)中，储存于-20℃备用。将emblin原液用培养液稀释至终浓度为0～60 μmol/L。无血清DMEM加入葡萄糖(Fisher Scientific公司，美国Fair Lawn))至终浓度为5，10，25,50 mmol/L。

1.2Müller 细胞培养 根据文献〔1〕的方法，分离并培养Sprague-Dawley (SD) 大鼠的视网膜Müller细胞。SD大鼠处死后立即摘除眼球，去除角膜、晶状体、玻璃体等非视网膜组织后，将视网膜切成 1 mm×1 mm大小的组织块，以30 μm 尼龙筛过滤后加入0.25% 胰蛋白酶，37℃孵育30 min。收集滤过物，500 r/min离心5 min。Müller 种植于 6 cm培养皿，培养液为含有20%胎牛血清的DMEM(100 μg/ml 链霉素，100 U/ml青霉素)，在 37℃，5% CO2培养箱内孵育。 24 h后更换培养液，却掉未贴壁的杂质细胞，Müller细胞在DMEM培养液中继续生长，每3日更换一次培养液。以0.25%的胰蛋白酶和EDTA 37℃消化并分离贴壁的Müller细胞，第三代细胞用于实验。Müller细胞的鉴定是透射电镜下见到细胞质内特异性的中间丝结构。

1.3Western印迹分析 Müller细胞在不同葡萄糖浓度(5，10，25，50 mmol/L)和(或)emblin(0，15，30,60 μmol/L)的培养液中孵育72 h后，冷PBS清洗2次。提取总蛋白，每孔20 μg 蛋白质样本10% SDS-PAGE电泳，然后转至尼龙膜上。膜与一抗共孵育，包括XIAP(1∶250，BD Biosciences公司，美国San Jose)和VEGF (1∶1 000，Santa Cruz Biotechnology公司，美国)，4℃过夜。膜与结合了辣根过氧化物酶(Amersham，美国Arlington Heights)的抗兔抗体中孵育，化学发光法检测蛋白质，并且化学发光信号由ChemiDoc XRS 系统 (Bio-Rad公司，美国 Hercules)拍摄成像。同一张膜再用单克隆抗β-actin抗体(1∶10 000，美国Sigma公司)阻断。 每种蛋白质的信号由densitometric scanning (Quantity One software package，美国Bio-Rad公司)检测。

2 结 果

与正常葡萄糖浓度组相比，VEGF和XIAP蛋白质表达与葡萄糖浓度呈浓度依赖性，25 mmol/L葡萄糖组这两种蛋白质表达增加2倍，50 mmol/L葡萄糖组增加超过3倍(图1A)。高糖(50 mmol/L)条件的 Müller 细胞与不同浓度(15，30，60 μmol/L)的embelin共同培养72 h，进一步证实VEGF蛋白质表达与XIAP的关系。结果显示，embelin使XIAP蛋白质表达下降，从而导致 VEGF蛋白质表达下降(图1B)。

A：Western印迹分析显示，Müller细胞在不同葡萄糖浓度中培养72 h，随着葡萄糖浓度的增加，XIAP和VEGF蛋白质表达量逐渐增加；B：embelin抑制了 Müller细胞中XIAP和VEGF蛋白质的表达，这种抑制作用呈剂量依赖性

3 讨 论

Müller细胞在DR的病理过程中起到非常重要的作用。在糖尿病患者眼内Müller细胞作用表现为胶质细胞增生，细胞数量增多。这种增殖作用是Müller细胞中几条重要的信号传导通路共同参与的结果，包括 XIAP/凋亡信号通路、VEGF 信号通路和细胞循环调控通路等。这些信号传导通路的变化可以减少Müller 凋亡，促进细胞存活。并且，XIAP可能是这些信号通路的中心调控因子，将高糖信号传递到细胞周期中，促进细胞增殖。因此，应用XIAP的抑制剂embelin可以使高糖引起的信号通路的改变重新恢复到正常水平，抑制细胞增殖。

VEGF是一种最重要的促进新生血管生成和增加血管通透性的因子〔3〕。在视网膜中Müller细胞是VEGF产生的主要来源，尤其是在高血糖的情况下。本文研究证实，高糖可以刺激Müller细胞中VEGF蛋白质表达增加，提示高糖对于Müller 细胞中VEGF表达具有调控作用。

在本文中，高糖条件下，XIAP的表达强有力地调控了VEGF的表达，并且XIAP的抑制剂embelin使VEGF表达下调，提示XIAP在高糖诱导的VEGF表达中起着调控作用。XIAP是凋亡抑制因子(IAP)家族中的一员，是细胞凋亡的内在调控因子。近期研究证实，IAPs不仅调控半胱天冬酶和凋亡，而且调节炎症通路、免疫通路、有丝分裂酶通路、增殖通路和有丝分裂通路〔5〕。例如，近期报道显示，XIAP 通过它的RING指结构调控泛素(ubiquitin，Ub)依赖性IκB 酶(IKK)激活，IκB 酶可以激活NFκB〔6〕。通过经典和非经典信号通路，NFκB调控下游基因uPA〔5〕，IL-1β〔7〕，CREB和TNF-α〔8～10〕的表达，这些蛋白质可以增加VEGF的表达〔10,11〕。

因为XIAP在高糖诱导VEGF表达增加中起着至关重要的调节作用，因此XIAP将成为DR治疗的潜在靶点。embelin是植物 embelia ribes的提取物，是一种细胞通透性小分子XIAP抑制剂〔12〕。embelin具有抗肿瘤，抗炎以及止痛等作用。本研究显示，在Müller细胞中embelin可以抵消高糖诱导VEGF高表达，提示embelin具有治疗DR的作用。

综上，XIAP是高糖诱导的Müller细胞病理改变的中心调控因子，而embelin是XIAP的选择性抑制剂，有预防和治疗DR的作用。

4 参考文献

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