煤工肺尘埃沉着病患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞水平与肺功能关系

李 超 袁宝军 邹吉敏 王冬梅 张淑青

(开滦总医院检验科，河北 唐山 063000)

煤工肺尘埃沉着病(CWP)是一种慢性弥漫性肺间质纤维化疾病，以肺功能损伤为主。目前，肺功能测定依然是观察肺尘埃沉着病病情及判断预后的主要指标。研究认为，矽肺患者外周血T淋巴细胞亚群对肺功能具有一定影响〔1〕。细胞免疫损伤可导致肺功能改变〔2〕。CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+Treg)是一群表型和功能特异的T淋巴细胞，具有独特免疫抑制调节功能，它可通过对早期炎性细胞的抑制来调节矽尘引发的炎症〔3〕。本研究探讨CWP患者外周血CD4+CD25+Treg水平及CD4+CD25+Treg/CD4+比值改变与肺功能关系。

1 对象与方法

1.1对象 2010～2011年开滦职业病防治院体格检查的在职和退休工人及住院的CWP患者145例(一期137例，二期8例)，年龄51～84〔平均(65.12±9.12)〕岁，接尘工龄10～38〔平均(29.46±6.51)〕年。均经开滦职业病防治院按照GBZ70-2009《尘肺病诊断标准》确诊CWP。对照组为具有与CWP组相同接尘条件的健康井下接尘矿工85例，年龄52～79〔平均(65.50±6.78)〕岁，接尘工龄10～37〔平均(28.40±4.55)〕年。两组均为男性，且无肝脏疾病、肾脏疾病、心脑血管疾病、糖尿病，也无肺部并发症、近期肺部感染史及免疫系统疾病。两组年龄及接尘年限差异均无统计学意义(P>0.05)。

1.2试剂和仪器 主要试剂：多甲藻叶绿素蛋白(PerCP)标记的抗CD45单克隆抗体，异硫氰酸荧光素(FITC) 标记的抗CD4单克隆抗体，藻红蛋白(PE) 标记的抗CD25单克隆抗体，同型对照IgG1 FITC /IgG2a PE双色单克隆抗体，以上试剂均购自美国 BD Biosciences。仪器：美国BD公司的FACSCalibur流式细胞仪，德国耶格的PTF肺功能机。

1.3标本采集 所有研究对象均采集早晨空腹静脉血2 ml，乙二胺四乙酸K2抗凝管保存，入院患者于治疗前采集，采集后6 h内处理。

1.4检测方法 取2支流式试管，各取100 μl抗凝全血，分别加入荧光标记CD4 FITC/CD25PE/CD45 PerCP， IgG1 FITC/IgG2a PE/CD45 PerCP单克隆抗体各20 μl，室温避光孵育20 min，加红细胞裂解液2 ml，涡旋混匀，避光10 min，300 r/min离心5 min，弃上清，用磷酸盐缓冲液清洗2次，加入含1%多聚甲醛的PBS 0.5 ml。置流式细胞仪按常规进行分析。以相应荧光标记的同型对照染色细胞为阴性对照，同时调节电压，阈值，各通道之间的荧光补偿，以CD45设定淋巴细胞门，测定CD4+CD25+和CD4+细胞比例，每个样品收集10 000个细胞。用cellquest软件分析结果。

1.5观察指标 用力肺活量(FVC)、1 s用力呼气量(FEV1)、用力呼气1 s率(FEV1/FVC)、最大呼气中期流速(MMEF75/25) 测定使用PTF肺功能机，按常规操作方法，依照仪器说明书要求有专人严格操作。

1.6统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行t检验和Pearson相关分析。

2 结 果

2.1两组外周血CD4+CD25+Treg、CD4+T细胞及其比值水平变化 与对照组比较，CWP组CD4+CD25+Treg、CD4+T细胞水平及CD4+CD25+/CD4+比值明显升高(P均<0.01)，见表1。

表1 两外周血CD4+CD25+Treg、CD4+T细胞及其比值水平变化

2.2两组肺功能四项指标水平变化 与对照组比较，CWP组FVC、FEV1、FEV1/FVC、MMEF75/25均明显降低(P均<0.05)，见表2。

表2 两组肺功能四项指标实测值占预计值的百分比

2.3外周血CD4+CD25+Treg 、CD4+T细胞及其比值与肺功能四项指标的相关性分析 CWP组患者外周血CD4+CD25+Treg与CD4+T细胞呈正相关(r=0.627，P<0.01)，CD4+CD25+/CD4+与FVC(%)呈正相关(r=0.293，P<0.05)；对照组CD4+CD25+Treg与CD4+T细胞呈正相关(r=0.590，P<0.01)，CD4+CD25+/CD4+与MMEF75/25呈正相关(r=0.430，P<0.05)；其他指标间无相关性。

3 讨 论

在矽肺大鼠的研究中发现，随着纤维化的形成逐步上升，CD4+CD25highT细胞和CD4+CD25+Foxp3+Treg数第28天达到高峰，细胞免疫功能严重紊乱，矽肺大鼠体内免疫耐受失衡〔4〕。博来霉素诱导的纤维化动物模型研究中也发现，肺组织中CD4+CD25+Foxp3+Treg显著升高，认为肺纤维化中CD4+CD25+Treg免疫抑制功能增强，导致小鼠肺内微环境及免疫系统改变〔5〕。本实验提示随着纤维化的形成，CWP患者CD4+CD25+Treg免疫抑制能力可能增强，免疫调节活性增加，在急性肺损伤的病理发展过程中，CD4+CD25+Treg发挥重要的免疫调节功能〔6〕。

本研究结果提示 CD4+CD25+Treg与辅助性T细胞比例的改变可打破免疫系统的免疫耐受，为促进肺纤维化提供了一个免疫系统过度激活的环境〔7〕。其作用机制可能是，CD4+CD25+Treg抑制同种异体抗原刺激的CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖所致〔8〕。表明CD4+CD25+Treg和CD4+T细胞在肺纤维化的发生发展过程中相互作用，发挥着重要的免疫调节功能，CD4+CD25+/CD4+比值改变可能影响体内细胞免疫功能状态。

肺功能测定是评价早期CWP患者肺功能损害和代偿功能分级的基本依据，其中FVC、FEV1、FEV1/FVC是反映大气道功能的指标，MMEF75/25是反映小气道功能的指标，肺纤维化可使肺泡扩张的弹性阻力增加，引起限制性通气不足，使通气换气功能受到严重损害〔9〕。此次研究结果表明随着CWP病情的进展，肺部的炎症水肿和纤维化进一步加重，肺实质的炎性细胞渗出和结缔组织增生使肺组织有效腔体较少，大小气道腔变窄或阻塞造成不同程度的损伤，CWP患者肺功能明显低下〔10〕。

另外，在对矽肺患者外周血T淋巴细胞与肺功能相关性研究中发现，CD8+T淋巴细胞可能具有加重小气道通气功能障碍的作用〔1〕，而肺尘埃沉着病患者外周血CD3+改变可影响肺弥散功能〔2〕。本研究认为CD4+CD25+/CD4+比值变化可间接反映大小气道通气能力，二者比值的增高可缓解炎症反应造成的通气能力障碍。

4 参考文献

1杨 阳,张晓晔.矽肺患者细胞免疫水平及肺功能的相关性研究〔J〕.中国实用医药,2008；3(13):60-2.

2杨琳红,王 珺,孔令敏,等.尘肺患者T细胞亚群的改变与肺功能的关系〔J〕.山东医药,2009；49(49)：86-7.

3Liu F，Liu J，Weng D,etal.CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells depletion may attenuate the development of silica-induced lung fibrosis in mice〔J〕.PLoS One,2010；5(11): 15404-14.

4李春红,朱 文,董西方.实验性矽肺模型大鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的变化及意义〔J〕.环境与职业医学,2010；27(8)：480-2.

5Du GJ，Jin LT，Han XJ,etal.Naringenin: a potential immunomodulator for inhibiting lung fibrosis and metastasis〔J〕.Cancer Res,2009；69 (7):3205-12.

6Venet F，Chung CS，Huang X,etal.Lymphocytes in the development of lung inflammation:a role for regulatory CD4+T cells in indirect pulmonary lung injury〔J〕.J Immunol,2009；183(5):3472-80.

7Brown JM，Pfau JC，Holian A.Immunoglobulin and lymphocyte responses following silica exposure in New Zealand mixed mice〔J〕.Inhal Toxicol,2004；16(3):133-9.

8Almeida AR，Legrand N，Papiernik M,etal.Homeostasis of peripheral CD4+T cells:IL-2R alpha and IL-2 shape a population of regulatory cells that controls CD4+T cell numbers〔J〕.J Immunol,2002；169(9):4850-60.

9高玉龙.100例尘肺患者肺通气功能分析〔J〕.中国工业医学杂志，2007；20(4):265-6.

10程淑群,任在鸣.Ⅰ期煤工尘肺患者肺功能的测定〔J〕.现代预防医学，2005；32(11):1556-9.